《续》
5.3 RAPD-PCR
RAPD-PCR（the random amplified polymorphicDNA-PCR）也称作AP-PCR（arbitrary primer PCR）是一种用任意的随机引物来检测DNA序列图谱的检测方法。由RAPD-PCR得出的特殊且特定的模型可以用来区分肉类的物种。RAPD-PCR不仅拥有简单、快速、重现性好、敏感度高、辨识性高等优点，并且可以在单次的PCR反应中同时检测多个物种的DNA。这种分析方法也适用于识别在不同的加工条件下的肉类和肉类产品的物种。
5.4 种特异性PCR
使用种特异性PCR（ species-specific PCR）鉴定肉和肉制品的物种比其他的PCR检测方法更加的简便、灵敏和快速。然而，单次PCR反应可检测的物种数量却被降低。这种PCR方法可以通过检测目标DNA或线粒体DNA来鉴定肉的种类。猪的特异性DNA引物已被成功用来鉴定各种肉和肉产品，如生肉、熟肉、香肠、腌肉产品和汉堡包等[32]。种特异性PCR方法由于其操作简单、高特异性和高灵敏度，是一个强大的牛肉鉴定手段，在加工和未加工的食物中皆适用。
线粒体DNA的12S rRNA，16S rRNA，d循环（D-loop）和细胞色素b区域（cytochrome b regions）
一般被用作目标物种鉴别的目标区域。通过使用设计在细胞色素b基因上的引物，种特异性PCR已成功应用于检测和区分食品中的鸡、火鸡、猪、牛和羊的成分。
5.5 PCR-RFLP
PCR-RFLP技术（the restriction fragment lengthpolymorphis），即限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术，其基原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。但这种技术较为复杂的，并需要相配的实验室，严格的分析技术和昂贵的酶。然而，这种分析方法针对熟肉的鉴定有着较大的潜能。有试验证明，PCR-RFLP可在肉类混合物中，鉴定出不到1%的水平的鸡和火鸡肉。同样，羊肉和山羊肉也可通过使用ApaI限制酶的PCR-RFLP分析来区分。
针对线粒体DNA使用PCR-RFLP技术，可以鉴别经过卤水、热处理和发酵的近缘的肉制品，包括猪、牛、野猪、野牛、绵羊、山羊、马、鸡、火鸡和野味等。然而，绝大多数的RFLP方法是适合用来定性检测单一物种的肉，而混合物会产生复杂的指纹，并不容易解读。
5.6 复合PCR
复合PCR技术（multiplex PCR）采用多对引物对目标基因与线粒体DNA进行测定，可以同步、准确和快速的在单次PCR反应中识别多个肉类品种。已有文献表明，复合PCR可以用来识别鸡肉、火鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉、驴肉和马肉，其对熟肉和加工肉类的检出限为1%。Dalmasso使用设定在线粒体12s rRNA基因的正向引物和特异性反向引物鉴定鹅、土番鸭、鸡、的火鸡和猪。
另有试验使用设定在5S rRNA基因正向引物和 特异性反向引物鉴定出混合在鹅肝中的鸭肝。
5.7 Real-Time PCR
常规的PCR技术虽然可以对不同物种的混合肉类进行定性检测，但却不能实现对产品中的物种进行定量。而Real-Time PCR（又称实时定量荧光PCR）不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。
有研究证实，通过对放大的线粒体12S rRNA基因、细胞色素b基因及16S rRNA基因进行Real-TimePCR试验可以鉴别混合肉中肉的成分。而设计后的探针可以定量的分析马肉、驴肉和猪肉的混合物，并且不局限于食物是否经过加工和现今实验人员可以通过对DNA进行测序来鉴定已知序列的肉类物种。经过实验人员的不断测序分析，现今已有大量的常见动物物种、品种和基因变异的基因序列存于数据库中，如美国国家生物技术信息中心的数据库等。
只要物种拥有独特的DNA序列，DNA测序都可以对其进行鉴定，就算是没有任何参考资料的未知样品也同样可以进行鉴定。试验方法为先通过PCR扩增来得到样品的DNA序列，然后将其与数据库中的大量已知物种信息进行比对，就可以得到样品的物种。通过PCR扩增来识别 DNA序列是一种非常直接和有效的方式，通常会伴随着凝胶电泳，并使用 Real-Time PCR对其结果进行定量分析。传统的Sanger测序技术是通过双脱氧链终止法对PCR反应完成时产物的长度进行的末端分析，得出模板链的碱基序列。然而由于Sanger测序法操作繁琐、成本较高，不能满足大规模测序的需要。新一代的测序方法则以高通量、低成本为主要特点，主要包括Illumina公司的Solexa测序技术、罗氏公司的454测序技术和ABI公司的SOLiD测序技术等，目前已广泛应用于生命科学研究的各个领域。
5.8 DNA条形码（DNA barcode）
2003年，加拿大Guelph大学的生物学家Paul Hebert教授首次提出利用线粒体细胞色素C氧化酶1（cytochromeC oxidase 1）基因构建物种鉴别体系，而这段拥有648个碱基对的基因序列则被称为DNA条形码（通常被简称作CO1或COI），并期待像在零售业的发展过程中起到了举足轻重作用的条形码技术一样，根据对1个统一的目标基因DNA序列的分析来完成物种鉴定的过程。
截止2011年已有112547种动物和近43 000植物、真菌和其他类型生物的DNA条形码已存入数据库中，并且这个数字还在不断增加。DNA条形码作为对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新技术， 受到国内外广泛关注。
在美国，为规范鱼类交易，避免以次充好，美国食品和药物管理局2011年年底宣布它将扩大其使用DNA检测在检查海鲜制造商和餐馆。
6 结论
现阶段可用于确定 肉类品种的方法大致可以分为5种： 物理技术、化学技术、免疫学技术、电泳技术、以及DNA鉴定技术。这些检测方法是基于肉类品种之间的解剖差异、化学分析、蛋白质或DNA鉴定而建立的。
物理和化学技术适合用于鉴定较为完整的生肉，并可以通过物理方法按照相应的标准对肉类的品质进行分级，并由于其操作简便，较为适用于现场执法工作。而碎肉、肉末以及仅经过适度加工的肉则适合采用免疫学和电泳方法，如SDS-PAGE、IEF和ELISA。
但是对于经过热加工的肉类而言，由于热加工会使肉类的蛋白质变性，因此基于DNA的检测方法拥有着更高的可靠性，如传统的DNA分析和实时PCR等。线粒体和基因组中的DNA均可以通过单拷贝和重复序列的方法PCR扩增序列，具体方法的选择会极大程度的受到检测极限的影响。如果需要定量的鉴定肉的种类，则需要选用基于实时PCR分析方法。最新的DNA条形码技术正受到国内外广泛关注，目前已越来越多的在肉类物种的鉴定和执法工作中采用。
