前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由农业农村部乡村产业发展司提出。
本文件由农业农村部农产品加工标准化技术委员会归口。
本文件起草单位：中国农业科学院农产品加工研究所、河南双汇投资发展股份有限公司、唐人神集团股份有限公司、新希望六和股份有限公司、东北农业大学、中粮集团营养健康研究院、湖北安井食品有限公司。
本文件主要起草人：张德权、惠腾、王振宇、孔保华、孟少华、刘欢、丁晓倩、单吉浩、张晓琳、潘腾、刘志斌、胡忠良。
1 范围
本文件规定了附录A给定的肉及肉制品中13种杂环胺的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于附录A给定的肉及肉制品中13种杂环胺的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
试样采用乙腈提取，分散固相萃取净化，液相色谱-串联四级杆质谱仪检测，外标法定量。
4 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1 试剂
4.1.1 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。
4.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
4.1.3 乙酸铵（CH3COCNH4）：纯度≥98%。
4.1.4 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
4.1.5 硫酸镁（MgSO4）：优级纯。
4.1.6 无水醋酸钠（CH3COONa）：优级纯。
4.2 材料
4.2.1 陶瓷均质子：适用于50mL萃取管。
4.2.2 N-丙基乙二胺（PSA）：粒径40μm～60 μm。
4.2.3 封尾C18固相萃取填料：粒径40μm～63 μm。
4.2.4 有机相型微孔滤膜：0.22μm。
4.3 试剂配制
4.3.1 1%乙酸-乙腈溶液：量取1.0mL乙酸（4.1.1）至100mL容量瓶中，用乙腈（4.1.2）稀释并定容至刻度，摇匀。
4.3.2 乙酸-乙酸铵缓冲液：准确称取0.7708g乙酸铵（4.1.3），溶于100mL水中，用乙酸（4.1.1）调pH至2.90，转入1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
4.4 标准品
杂环胺标准品：应满足附录A的要求。
4.5 标准溶液配制
4.5.1 杂环胺标准储备液：分别称取10.0mg GIu-P-2、IQx、MelQ.GIu-P-1、8-MeIQx、Norharman、4,8-DiMeIQx、7,8 -DiMelQx、Harman、4,7,8 -TriMeIQx、PhIP、AaC、Trp-P-1（4.4）于100mL容量瓶中，用甲醇（4.1.4）配制成浓度为100μg/mL的储备液；吸取10.0mL储备液到100mL容量瓶中，用甲醇（4.1.4）稀释为10.0μg/mL的标准储备液，-18℃避光保存,有效期1个月。
4.5.2 混合标准工作液：分别吸取0.01mL、0.02mL、0.05mL、0.10mL、0. 20mL、0.50mL杂环胺标准储备液（4.5.1）于100ml容量瓶中，用甲醇（4.1.4）稀释，得到杂环胺浓度分别为1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的混合标准溶液，现用现配。
5 仪器设备
5.1 液相色谱串联四极杆质谱：配有电喷雾离子源。
5.2 电子天平：感量0.0001g和0.01g。
5.3 离心机：转速≥10 000r/min。
5.4 pH计：感量0.01。
5.5 氮气浓缩仪。
5.6 涡旋振荡器 。
5.7 均质器。
5.8 色谱柱：Zorbax SB-C18（2.1mm×50mm，1.8μm）。
注：非商业声明，此处列出的色谱柱仅供参考，不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家的色谱柱。
6 分析步骤
6.1 试样制备
取试样肉及肉制品中可食部分，捣碎混匀，标识后-18℃冷冻保存。
6.2 试样处理
6.2.1 提取
称取捣碎试样2g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入1块陶瓷均质子（4.2.1）和10mL水，振荡20min；加入10mL 1%乙酸-乙腈溶液（4.3.1），振荡15min；加入4.0g硫酸镁（4.1.5）和1.0g无水醋酸钠（4.1.6），涡旋混合1min。试样提取液在4℃、10 000r/min条件下离心10min，分为上、中、下3层，上层为含杂环胺的有机溶液，中层为肉泥，下层为水和陶瓷均质子，取上层有机溶液6mL供净化使用。
6.2.2 净化
向离心后的6mL待净化有机溶液中加入0.9g硫酸镁（4.1.5）、0.3g N-丙基乙二胺（PSA）（4.2.2）和封尾0.3g C18固相萃取填料（4.2.3），在1 000r/min条件下均质1min，然后在4℃、10 000r/min的条件下离心5min；离心后取1.0mL上清液在30℃条件下氮气浓缩至近干，加入0.50mL甲醇（4.1.4）溶液复溶得试样溶液，涡旋混匀，将试样溶液经微孔滤膜（4.2. 4）过滤至进样瓶，待上机测定。
6.3 测定条件
6.3.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：Zorbax SB-C18（2.1mm×50mm, 1.8μm）；
b）流动相：A为乙酸-乙酸铵缓冲液（4.3.2），B为乙腈（4.1.2），梯度洗脱程序参见表1；
c）流速：0.4mL/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：2.0μL。
6.3.2 质谱参考条件
a）电离方式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；
b）扫描方式：多反应监测(MRM)；
c）干燥气温度：200℃；
d）干燥气流量：10L/min；
e）雾化气压力：40V；
f）鞘气温度：260℃；
g）鞘气流量：11Lmin；
h）毛细管电压：正电压4 000V；
i）喷嘴电压：正电压0V；
j）定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。
6.4 液相色谱-串联质谱测定
6.4.1 定性测定
通过液相色谱将试样溶液进行分离后注入串联四极杆质谱仪中，得到相应的保留时间及信号响应值。试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。
6.4.2 定量测定
以杂环胺混合标准工作液中杂环胺的浓度为纵坐标，以峰面积（响应值）为横坐标，绘制标准曲线，按照外标法进行定量。通过液相色谱将试样溶液进行分离后注入串联四极杆质谱仪中，得到相应的响应值，根据标准曲线得到目标化合物的浓度。待测试样溶液中杂环胺的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应重新分析。重新分析时，根据超出线性范围倍数估算稀释倍数，用甲醇稀释使试样溶液浓度尽量处于线性范围中部。杂环胺标准溶液的液相色谱图见附录B，特征离子质量色谱图见附录C。
6.5 空白试验
除不加试样外，采用6.2的步骤进行平行操作。
7 结果计算和表述
试样中杂环胺含量按公式（1）计算。
式中：
X--试样中杂环胺含量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
n--待测试样溶液稀释倍数；
c--根据标准曲线上计算得出的试样溶液中杂环胺浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
V--复溶后的试样溶液体积的数值，单位为升（L）；
m--试样质量的数值，单位为千克（kg）。
计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
8 回收率和精密度
在3μg/kg～30μg/kg添加浓度范围内的回收率为65%～100%，批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
9 检出限和定量限
检出限和定量限见表4。
附录A
（规范性）
13种杂环胺的信息
13种杂环胺的信息见表A.1。
附录B
（规范性）
13种杂环胺标准溶液的液相色谱图
13种杂环胺标准溶液的液相色谱图见图B.1。
标引序号说明：
1--GIu-P-2； 2--IQx； 3--MeIQ； 4--GIu-P-1； 5--8-MeIQx； 6--Norharman；7--4,8-DiMeIQx； 8--7,8-DiMeIQx；
9--Harman； 10--4,7,8-TriMelQx； 11--PhIP；12--AaC； 13--Trp-P-1。
图B.1 13种杂环胺标准溶液的液相色谱图（50.0μg/L）
附录C
（规范性）
13种杂环胺标准溶液的特征离子色谱图
13种杂环胺标准溶液的特征离子色谱图C.1，（略）
本标准由中华人民共和国农业农村部于2021年5月7日发布，2021年11月1日实施。
