摘要：研究发酵蔬菜汁替代化学合成亚硝酸盐在牛肉肠中的作用效果。以木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌作为发酵剂，不同添加量（5%、10%、15%和20 %）的菠菜汁和胡萝卜汁为试验组制作牛肉肠，添加亚硝酸盐（添加0.01%）组为对照组，通过模糊综合评价法和牛肉肠的亚硝酸盐含量筛选最佳蔬菜汁；比较无亚硝酸盐蔬菜汁组、亚硝酸盐蔬菜汁组和发酵蔬菜汁组3种不同处理方式的牛肉灌肠在贮藏期间菌落总数、TBARS值、TVB-N、pH和色差的变化。添加15 %和20%发酵菠菜汁制作的牛肉灌肠感官评价均较好，但是20%的发酵菠菜汁在24 h的亚硝酸盐残留量达到31.137mg/kg，超出国标允许范围内，所以选择15%的发酵菠菜汁。在贮藏过程中，添加15%发酵菠菜汁制作的蔬菜牛肉发酵肠的微生物指标、理化指标和肉色指标与添加0.01%亚硝酸盐制作的牛肉灌肠相当。本研究得出在牛肉灌肠制作中，供试菌发酵15%菠菜汁产生亚硝酸盐可替代直接添加0.01%化学合成亚硝酸盐。
关键词：发酵蔬菜汁；牛肉灌肠；亚硝酸盐；替代
发酵香肠是西方国家将其传统制品与现代生物技术结合而开发出的一类高档肉制品，是指将绞碎的肉（通常为猪肉或牛肉）、动物脂肪、盐、发酵剂和香辛料等混合后灌进肠衣，在自然或人工控制条件下，经过微生物发酵作用而产生的具有特殊风味、色泽和质地，且具有较长保存期的肉制品。在肉腌制时加入亚硝酸盐能够使肉品产生诱人的红色，起到抗氧化和提高风味的作用，对肉毒梭状芽孢杆菌具有抑制其产生毒素的作用，从而保证肉制品的安全，尽管其能够起到许多有益作用，但亚硝酸盐能与肉制品中的次级胺作用生成N-亚硝基化合物，具有强致癌性，严重威胁着人们的健康。因此，寻找亚硝酸盐在肉制品中的替代物是近年来国内外学者关注的焦点。有研究报道肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌和一些微球菌能产生硝酸盐还原酶，将硝酸盐转化为亚硝酸盐。李沛然研究表明自制发酵芹菜粉能够作为一种替代合成型亚硝酸钠的天然腌制剂。Krause[8]将富含硝酸盐的蔬菜与具有硝酸盐还原作用的肉葡萄球菌发酵系统反应，生成了200 mg/kg～230 mg/kg 的亚硝酸盐，并且加入发酵芹菜的灌肠在42d内与加入亚硝酸钠的灌肠在红度方面没有明显差异（P＞0.05），亚硝酸钠组在一个星期内的亚硝酸盐残留量显著高于发酵芹菜组（P＜0.05）。说明利用微生物对肉制品发酵，可以促进肉的发色作用，减少亚硝酸盐残留量，从而提高肉制品的安全性。
本研究利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌混和发酵胡萝卜汁、菠菜汁产生亚硝酸盐来代替直接添加亚硝酸盐生产蔬菜牛肉发酵肠，研究其替代效果，为开发这种新型食品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
新鲜菠菜、红萝卜、牛背最长肌、天然肠衣：均购于本地的农贸市场。
1.1.2 供试菌
肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌：购买于意大利SAC-CO公司。
1.1.3 主要辅料和试剂
玉米淀粉、胡椒粉、桂皮、八角、小茴香、良姜、陈皮、亚硝酸盐：均为食品级；2-硫代巴比妥酸、氯仿、二氯化汞、氨基苯磺酸、盐酸萘胺、硼酸、氧化镁：均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
ZB-5 型斩拌机；HPP-9272 型电热恒温培养箱；YXD-912 型自动控温食品电烤炉；SP-XC-ZK01 型台式真空包装机；SHZ-B 型水浴恒温振荡器；2100 型分光光度计；FA25 型高剪切分散乳化机；LD5-2B 型低速离心机；SP-XC-SD01 型酸度计；TCPZ 型全自动测色色差计。
1.3 试验设计
以牛肉、菌种的添加量（肉重的0.02%）为定量，添加0.01 %亚硝酸盐为对照组，胡萝卜汁和菠菜汁的添加量以5%、10%、15 %、20%分别与牛肉混合制成8 组牛肉灌肠，用感官评价和亚硝酸盐的含量为评定指标，挑选出最佳方案进行贮藏试验。
用最佳方案的蔬菜汁种类和添加量为定量制作3组灌肠，分别为无亚硝酸盐阴性对照组：蔬菜汁；亚硝酸盐阳性对照组：0.01%亚硝酸盐、蔬菜汁；发酵试验组：0.02%菌种、蔬菜汁。
独立真空包装后在4℃冰箱中冷藏。分别在贮藏期的0、1、4、7、14、21d 测定3 组灌肠的菌落总数、亚硝酸盐残留量、TBARS值、TVB-N值、pH值、色差。
1.4 工艺流程
辅料 蔬菜汁、活化的菌种
↓ ↓
原辅料处理→腌制→斩拌→拌料→灌制→结扎→发酵→煮制→烤制→成品
操作要点：
原辅料处理：牛肉去除筋腱、较厚的肌外膜切分成1 cm3小丁块，胡萝卜、菠菜汁经清洗切分匀浆后置于冰箱中保鲜备用，称量0.02 %肉重的菌种添加到50 mL 灭菌的牛奶（含1.4 %葡萄糖）中并常温放置3 h以活化菌种，桂皮、八角、小茴香、良姜、陈皮按质量比为1∶3∶2∶2∶1 的比例熬制香辛料水并置于冰箱中备用；
腌制：牛肉中加入肉重的10%香辛料水、2%盐、1%蔗糖、2%蒜、0.2%味精、1%料酒、1%酱油、0.2%胡椒粉，搅拌均匀后置于4℃的冰箱中12h；
拌料：8 个试验组分别添加肉重的5%、10%、15%、20%的胡萝卜汁和同水平的菠菜汁、0.02%菌种、7%淀粉并搅拌均匀，对照组添加0.01%亚硝酸盐、7%淀粉后混匀；
发酵：8 个试验组在38℃恒温培养箱中发酵4 h，对照组在4℃冰箱放置4 h；
煮制：70 ℃～80 ℃水中煮制15 min；
烤制：50 ℃电烤炉中烤制30 min。
1.5 指标测定方法
1.5.1 感官评分标准
10位身体状态良好、具有一定食品科学知识的感官评定员对9个样品进行色泽、风味、口感、质地方面的感官评价。鉴于各位感官评定员对相似样品的评价会有一定的模糊性和主观性，为得到更客观的实际结果，应用模糊综合评价方法来分析数据。
模糊综合评价的数学模型：
设定论域U=色泽，风味，口感，质地；设定评语集V=很好，好，一般，差，其中，很好（4 分）、好（3分）、一般（2 分）、差（1分）；确定评价指标权重集A=（0.2，0.2，0.3，0.3），即色泽2 分，风味2分，口感3分，质地3分，共10分；模糊关系综合评判集Y = A·R，R为模糊矩阵。
表1 9 组牛肉灌肠的感官评定标准
| 因素 | 很好（4分） | 好（3分） | 一般（2分） | 差（1分） |
| 色泽（20％） | 表面颜色鲜亮、切面色泽均匀、光泽感极好 | 外观色彩较鲜亮、切面色泽均匀、光泽感好 | 切面色泽较差、分布不均、光泽暗淡 | 有异色、无光泽 |
| 风味（20％） | 味道纯正适中、后味饱满、香气诱人 | 味道较好、香气较浓或较淡 | 味道不足，稍有不良气味 | 滋道差、有异常气味 |
| 口感（30％） | 口感细腻、咀嚼性好 | 口感较细腻、咀嚼性稍好 | 口感稍粗糙、入口不实或较硬，稍有残留渣 | 口感粗糙、入口过硬无咀嚼性、残留渣多 |
| 质地（30％） | 切面状态致密、界面清晰、富有弹性 | 切面状态较致密、界面清晰、弹性好 | 切面有小气孔、界面不整齐、弹性差 | 切面小气孔多、界面不整齐、指压即崩溃 |
1.5.2 亚硝酸盐含量的测定
参考国标法中的分光光度法。
1.5.3 菌落总数的测定
牛肉灌肠在4℃冷藏期间测定0、1、4、7、14、21d的菌落总数，参照GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验-菌落总数测定》中的方法测定。
1.5.4 TBARS 值的测定
TBARS 值的测定参照Vyncké、S覬rensen 和J覬rgensen的方法。
牛肉灌肠在4℃冷藏期间测定0、1、4、7、14、21d的TBARS 值。
1.5.5 挥发性盐基氮的测定
牛肉灌肠在4℃冷藏期间测定0、1、4、7、14、21d的TVB-N，采用半微量定氮法，参考GB/T 5009.44-
2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》
1.5.6 酸碱度的测定
牛肉灌肠在4℃冷藏期间，测定0、1、4、7、14、21d的pH。精确称量5 g灌肠碎样，加入15 mL 蒸馏水，匀浆30 秒后测定pH。
1.5.7 色差测定
牛肉灌肠在4 ℃冷藏期间，用色差计测定0、1、4、7、14、21 d 的色差。
1.6 数据分析
运用Statistix8.1 分析软件对测定指标进行显著性分析，比较方法为Tukey HSD，Alpha 为0.05；利用SigmaPlot10 软件作图。
2 结果与分析
2.1 最佳蔬菜汁添加量试验
2.1.1 蔬菜汁的添加量对灌肠感官品质的影响
按照模糊综合评价法对表2进行评定。
表2 不同蔬菜添加量的灌肠的感官评定结果
| 指标 | 色泽 | 风味 | 口感 | 质地 | ||||||||||||
| 很好 | 好 | 一般 | 差 | 很好 | 好 | 一般 | 差 | 很好 | 好 | 一般 | 差 | 很好 | 好 | 一般 | 差 | |
| A | 10 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | 4 | 2 | 8 | 2 | 0 | 0 | 9 | 1 | 0 | 0 |
| B1 | 8 | 2 | 0 | 0 | 5 | 4 | 1 | 0 | 6 | 4 | 0 | 0 | 8 | 2 | 0 | 0 |
| B2 | 6 | 3 | 1 | 0 | 5 | 4 | 1 | 0 | 3 | 7 | 0 | 0 | 5 | 5 | 0 | 0 |
| B3 | 2 | 4 | 4 | 0 | 8 | 2 | 0 | 0 | 2 | 7 | 1 | 0 | 1 | 8 | 1 | 0 |
| B4 | 1 | 3 | 6 | 0 | 4 | 5 | 1 | 0 | 0 | 6 | 4 | 0 | 0 | 6 | 4 | 0 |
| C1 | 6 | 4 | 0 | 0 | 0 | 4 | 6 | 0 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7 | 3 | 0 | 0 |
| C2 | 5 | 4 | 1 | 0 | 4 | 5 | 1 | 0 | 5 | 5 | 0 | 0 | 3 | 6 | 1 | 0 |
| C3 | 3 | 5 | 2 | 0 | 6 | 4 | 0 | 0 | 2 | 6 | 2 | 0 | 0 | 7 | 3 | 0 |
| C4 | 1 | 2 | 7 | 0 | 3 | 4 | 3 | 0 | 0 | 3 | 7 | 0 | 0 | 5 | 5 | 0 |
注：A 为亚硝酸盐组；B1、B2、B3、B4 分别为5 %、10%、15 %、20%的胡萝卜汁组；C1、C2、C3、C4 分别为5 %、10 %、15 %、20 %的菠菜汁组。
从表2 可以看出不加蔬菜汁的亚硝酸盐组的产品感官评价为很好，菠菜汁组添加5%和10%的产品评价均为很好或好，添加15%和20%的评价为好或一般；胡萝卜汁组添加10%的产品评价为很好或好，添加15%和20%的评价为好或一般。与亚硝酸盐对照组相比，添加菠菜汁或胡萝卜汁的发酵肠感官品质较差。
2.1.2 亚硝酸盐的含量变化
亚硝酸盐的含量变化见表3。
表3 不同组别灌肠亚硝酸盐的含量 mg/kg
| 组别 添加量/％ | 测定时间/h | |||
| 0 | 12 | 24 | ||
| 亚硝酸盐 | 0.01 | 72.200±0.5Aa | 67.483±0.5Ab | 64.371±0.3Ae |
| 胡萝卜汁 | 5 | 0.215±0.02Fe | 0.251±0.01Hb | 0.301±0.04Ia |
| 10 | 0.243±0.04Fe | 0.288±0.02Hb | 0.428±0.01Ha | |
| 15 | 0.491±0.03Fe | 1.396±0.03Gb | 1.645±0.02Ca | |
| 20 | 0.537±0.01Fe | 1.885±0.01Fb | 2.091±0.01Fa | |
| 菠菜汁 | 5 | 5.368±0.02Fb | 5.121±0.09Fe | 5.512±0.1Fa |
| 10 | 15.556±0.2De | 23.664±0.4Db | 24.024±0.2Da | |
| 15 | 21.813±0.5Ce | 28.554±0.5Cb | 29.184±0.1Ca | |
| 20 | 22.423±0.1Be | 29.500±0.1Bb | 31.137±0.3Ba | |
注：同列大写字母不同表示同一指标不同处理间差异显著（P＜0.05）；同行小写字母不同表示不同时间差异显著（P＜0.05）。
由表3 可以看出，随着时间延长，亚硝酸盐对照组的亚硝酸盐残留量呈下降趋势，差异显著（P＜0.05）。对于蔬菜汁组，除了5 %菠菜汁组外，其余各组亚硝酸盐残留量随着时间延长呈显著上升趋势（P＜0.05）。同一时间内，亚硝酸盐对照组的亚硝酸盐残留量远远高于蔬菜组（P＜0.05）。菠菜汁组在同一时间内，随着菠菜汁添加量的增加，亚硝酸盐残留量呈显著升高的趋势（P＜0.05），分别以添加5 %和20 %时表现最低和最高。胡萝卜汁组在同一时间内，随着胡萝卜汁添加量的增加，亚硝酸盐残留量呈现上升趋势，5%和10%添加量组差异不显著（P＞0.05），15 %和20%添加量组在12h 和24h 亚硝酸盐残留量差异显著（P＜0.05）。蔬菜汁组以20 %菠菜汁在24h 测得的亚硝酸盐残留量最高，达到31.137mg/kg。
2.2 贮藏期间的品质变化
由于胡萝卜汁组的亚硝酸盐含量都很低，不作为贮藏试验的考虑对象。虽然15 %和20 %的菠菜汁的感官评价均较好且测得的亚硝酸盐残留量较高，但是20 %的菠菜汁在24 h 其残留量超过了国标规定的亚硝酸盐残留量，所以综合考虑以15 %的菠菜汁添加量进行贮藏试验，研究比较其与0.01 %亚硝酸盐的菠菜牛肉灌肠的品质优劣。
2.2.1 不同组别牛肉灌肠菌落总数的变化
不同组别牛肉灌肠菌落总数的变化见图1。
从图1 可以看出，3组灌肠在贮藏期间，菌落总数呈显著上升趋势（P＜0.05），其中无亚硝酸盐对照组的上升幅度最大。除第21 天外，亚硝酸盐对照组与发酵试验组差异不显著（P＞0.05）。以菌落总数看，利用菌种发酵菠菜汁产生亚硝酸盐在抑菌效果方面与添加化学合成亚硝酸盐相当。贮藏4d内菌落总数增长缓慢，原因是在真空包装环境下，微生物要重新调整代谢以适应缺氧环境；4d后菌落增长速度加快。
图1 不同组别灌肠在贮藏期间菌落总数的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P＜0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P＜0.05）
2.2.2 不同组别牛肉灌肠亚硝酸盐残留量的变化
不同组别牛肉灌肠亚硝酸盐残留量的变化见图2。
图2 不同组别灌肠在贮藏期间亚硝酸盐残留量的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P＜0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P＜0.05）。
从图2 可以看出，在贮藏期内，3 组灌肠的亚硝酸盐残留量差异显著（P＜0.05），亚硝酸盐组最高，不添加亚硝酸盐组最低，随着贮藏期的延长，亚硝酸盐残留量有逐渐升高的趋势（P＜0.05），这是因为在贮藏期间菠菜与细菌作用产生了微量的亚硝酸盐。亚硝酸盐组在贮藏14d 后亚硝酸盐下降缓慢，残留量接近46 mg/kg。发酵组中亚硝酸盐的含量均低于亚硝酸盐组，高于无亚硝酸盐组，在第1 天时最高，接近29 mg/kg，随后下降趋势显著（P＜0.05），符合国际亚硝酸盐残留量低于30mg/kg 的规定。可见，发酵组优于亚硝酸盐组。
2.2.3 不同组别牛肉灌肠TBARS 值的变化
不同组别牛肉灌肠TBARS 值的变化见图3。
图3 不同组别灌肠在贮藏期间TBARS 值的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P﹤0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P﹤0.05）。
TBARS 是检测油脂氧化产物丙二醛的含量反映样品的氧化程度，数值越大，脂质氧化越严重。3 组灌肠的TBARS 值都随时间的延长而增大（P﹤0.05），同一时间内，无亚硝酸盐组TBARS 数值最大，脂质氧化程度最高；除第21 天外，发酵组与亚硝酸盐组TBARS值差异不显著（P﹤0.05），表明通过菌种发酵可以抑制脂质过氧化。
2.2.4 不同组别牛肉灌肠TVB-N 值的变化
不同组别牛肉灌肠TVB-N 值的变化见图4。
图4 不同组别灌肠在贮藏期挥发性盐基氮值的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P﹤0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P﹤0.05）。
挥发性盐基氮值是表示肉制品新鲜度的一个指标，数值越大，新鲜度越低。国家规定：鲜肉≤ 20 mg/100g；变质肉> 20 mg/100g。由图4 可以看出，3组灌肠的TVB-N 值随贮藏时间的延长均呈上升趋势（P＜0.05），7d 前，上升缓慢，后期上升速度加快。同一贮藏期内，无亚硝酸盐组TVB-N 值最大，发酵组次之，亚硝酸盐组最小。第21 天时，3 组灌肠的TVB-N 值都低于15 mg/100g，鲜度在鲜肉范围内，这是真空包装、低温冷藏和亚硝酸盐可抑菌等共同作用延缓了腐败变质。无亚硝酸盐组因亚硝酸盐含量微乎其微，新鲜度比另外两组差。
2.2.5 不同组别灌肠制品pH的变化
不同组别灌肠制品pH的变化见图5。
图5 不同组别灌肠在贮藏期间pH 的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P﹤0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P﹤0.05）。
从图5 可以看出，3组灌肠在贮藏1d时pH下降，随后均呈上升的趋势（P＜0.05），但上升幅度不大。在同一贮藏期内，贮藏时间超过1 天后发酵组的pH比无亚硝酸盐组和亚硝酸盐组的都低，基本上都低于6.0，这更助于亚硝酸盐发挥抑菌作用和呈色作用。
2.2.6 不同组别灌肠制品a* 值的变化
不同组别牛肉灌肠a* 值的变化见图6。
图6 不同组别灌肠在贮藏期间a* 值的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P﹤0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P﹤0.05）。
牛肉的颜色是红色的，由于菠菜汁的添加，3 组灌肠的颜色总体偏向绿色。由图6 可知，除第21 天外，a*值都是负值。除第14 天外，发酵组与亚硝酸盐组a* 值差异不显著（P＞0.05）；发酵组与亚硝酸盐组a* 值差异显著（P﹤0.05）。总体来看，a* 值有上升趋势，以无亚硝酸盐组更为明显（P＜0.05）。a* 值变化与叶绿素的降解和亚硝酸盐的显色作用有关。
2.2.7 不同组别牛肉灌肠b* 值的变化
不同组别牛肉灌肠b* 值的变化见图7。
图7 不同组别灌肠在贮藏期间b* 值的变化
注：不同大写字母表示同一指标不同处理间差异显著（P﹤0.05）；小写字母不同表示不同时间差异显著（P﹤0.05）。
b*值表示黄蓝，正值是偏向黄色，负值偏向蓝色。b*值越大，肉的色泽感觉越差。由图7 可以看出，在贮藏期间，3组灌肠的b*值都是正值，且呈现波浪状的变化。在整个贮藏期间，不同组之间的差异显著性不断在改变。b*值上的差异与菠菜中各色素的变化有关，叶绿素性质不稳地，随贮藏时间的延长不断损失，使呈黄色的类胡萝卜素占优势，即菠菜逐渐由绿色变为黄色。
3 讨论
3.1 胡萝卜汁与菠菜汁的选择
本研究中，相同添加水平的胡萝卜汁组和菠菜汁组，灌肠产品的感官综合评价基本相同，菠菜汁组灌肠亚硝酸盐产生量是胡萝卜汁组的10 倍以上，但是比亚硝酸盐组亚硝酸盐残留量更低，兼顾健康和产品品质的要求，选择菠菜汁组。在菠菜汁组， 15 %添加量和20 %添加量组感官综合评价和亚硝酸盐残留量均高，但是20 %添加量组在24h 的亚硝酸盐残留量超出了国标规定的范围，所以，在制作蔬菜牛肉发酵肠时，选择15%菠菜汁。
3.2 影响亚硝酸盐残留量的因素
在酸性环境下，灌肠中的一些还原性物质将亚硝酸盐分解成NO，其与肌红蛋白结合形成稳定的亚硝基肌红蛋白，肌红蛋白越多，消耗的亚硝酸盐就越多。牛肌肉中肌红蛋白的含量与品种、年龄、性别、运动量、肌肉部位有关。年龄越大、运动量越多的公牛含更多的肌红蛋白，牛的部位中腿肉、臀肉比里脊、眼肉、外脊多。肉中的pH会影响到亚硝酸盐与肌红蛋白的呈色作用，pH在5.6～6.0 能更好地发色。同时牛肉越新鲜、腌制温度越高、时间越长亚硝酸盐的残留量也越少。亚硝酸盐也可作为抗氧化剂抑制脂质氧化，脂肪含量也影响其残留量。
4 结论
选择15 %菠菜汁制作的蔬菜牛肉发酵肠在贮藏过程中，其微生物指标、理化指标和肉色指标与添加0.01%亚硝酸盐制作的牛肉灌肠相当。在牛肉灌肠制作中，供试菌发酵15%菠菜汁产生亚硝酸盐可替代直接添加0.01%化学合成亚硝酸盐。
