豆蔻精油纳米脂质体的制备及在不同肉制品中的应用

　　摘要：以研究豆蔻精油纳米脂质体的制备及其在不同肉制品中的应用为目的，试验中将精油包裹在纳米脂质体里面，可以显著提高精油的稳定性与在肉制品中的抗菌保鲜效果。通过薄膜-超声分散法制备得到的豆蔻精油纳米脂质体，当豆蔻精油浓度为4 mg/mL 时，纳米脂质体的稳定性最佳，具有良好的分散性及包裹率，平均粒径为145.6 nm，PDI为0.198，Zeta 电位为-49.2 mV，包封率为28.5%。此外，通过平板菌落计数法分别测定了豆蔻精油和豆蔻精油纳米脂质体在猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉中对大肠杆菌及单核细胞增生李斯特菌的生长抑制作用，最终发现豆蔻精油易挥发，抑菌效果短暂，第5d 后，细菌数又重新达到8.3 Log CFU/mL，而豆蔻精油纳米脂质体对细菌具有长效抑菌效果，到第7d仍然维持在5.0 Log CFU/mL 左右，杀菌率可达99.9%。

　　关键词：肉豆蔻精油纳米脂质体；抗菌活性；肉制品；大肠杆菌；单核细胞增生李斯特菌

　　近年来，科学家对植物精油的抑菌杀菌活性做了广泛的研究。许多植物精油具有广谱杀菌性，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌等均有一定的杀菌效果。谢小梅等发现豆蔻精油成

　　分有明显的抗菌作用。但其在常温下易挥发，有浓烈香味，低温下可能会有结晶析出。这些特性都会成为豆蔻精油的杀菌性能应用于实际生产时的问题。因此，为克服精油的这种缺陷，可以使用脂质体对精油进行包埋。近年来，对脂质体的研究取得很大进展，脂质体作为各种药物载体应用在化妆品、医药、食品等许多领域。

　　而肉制品中含有丰富的脂肪，蛋白质等，是微生物得以生长繁殖的天然媒介，易被微生物污染。大肠杆菌广泛存在于人和温血动物中，受到大肠杆菌污染的食品被食用进入人体后，可以引发肠道疾病甚至是严重的败血症。此外目前我国市场上大多是冷鲜肉，在4℃贮藏环境下单核细胞增生李斯特菌仍可生长繁殖，很容易引发食源性疾病。因此，本文通过研究豆蔻精油纳米脂质体对大肠杆菌及单核细胞增生李斯特菌的抗菌效果及其在肉制品中的应用，拟探寻豆蔻精油纳米脂质体的应用前景，为以后豆蔻精油在肉制品中更好的应用打下基础。

　　大肠杆菌，单核细胞增生李斯特菌，由江苏大学食品与生物工程学院提供，并储存于-80℃的液体培养基（NB）中，所有菌株培养在 37℃和150转的液体培养基中。

　　营养肉汤和琼脂培养基，大豆卵磷脂，胆固醇， 三氯甲烷， 聚乙烯吡咯烷酮，生理盐水；磷酸缓冲液 PBS（无水磷酸二氢钠∶磷酸氢二钾=2∶1）；豆蔻精油由。

　　旋转蒸发器（RE-2000B）；全温空气摇床（QYC 200）；高压蒸汽灭菌锅（YXQLS-50A）：；生物安全柜（HFsate-1200LC）；超声波细胞破碎仪（JY98- Ⅲ）；激光粒度仪（Nano ZS90）；冷冻离心机（Avanti J-25）；气相色谱-质谱联用仪（6890GC/5973NMSD）。

　　采用薄膜- 超声分散法制备豆蔻精油纳米脂质体。将大豆卵磷脂与胆固醇、豆蔻精油等加入圆底烧瓶中，旋转蒸发有机溶剂得到脂质薄膜，真空干燥，加入PVP 表面活性剂、磷酸缓冲液混合均匀，超微粉碎、离心，经微孔膜过滤后，可获得实验所需的纳米脂质体。再使用激光粒度仪，马尔文Zeta 电位仪以及GC-MS分析测定豆蔻精油纳米脂质体的粒径、PDI、Zeta 电位和包封率。

　　采用平板菌落计数法研究豆蔻精油纳米脂质体在猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉中的应用。将生长至对数期的大肠杆菌及单核细胞增生李斯特菌分别添加到不同肉制品中模拟培养基中，使菌液浓度为105～106 CFU/mL。然后向不同肉制品模拟培养基中分别添加豆蔻精油脂质体，使其浓度均为4mg/ mL。只添加菌液的试样做空白阴性对照，添加豆蔻精油的试样做阳性对照。将各试样放置在37℃空气摇床中，振荡（150 r/min）培养，分别测定培养了0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d和7 d 的残存菌数。

　　PDI 是指脂质体直径的多分散性。PDI 越小，脂质体直径分布越集中、均匀，PDI 数值在

　　0～0.3 之间表明体系具有均匀的分散性。见表1，精油浓度为4 mg/mL 时纳米脂质体的粒径为145.6 nm，PDI 为0.198，表明该脂质体分布较为集中、均匀。Zeta 电位又叫电动电位或电动电势（ζ-电位或ζ-电势），是表征胶体分散系稳定性的重要指标。分散粒子越小，Zeta 电位（正或负）越高，体系越稳定。一般Zeta 电位在±40到±60mV之间表示胶体分散体系具有较好的稳定性，而表1中 Zeta 电位为-49.2mV，在该稳定范围内。表明所制脂质体具有良好的稳定性。最后，表1 中包封率为28.5%，直接反映脂质体对豆蔻精油的包埋效果较好。

　　表1 豆蔻精油纳米脂质体的参数指标

　　由图1a 可以看出，在猪肉中，豆蔻精油对大肠杆菌具有良好的抑菌作用，但在5d 后，由

　　于精油挥发，细菌数又达到8.3 Log CFU/mL。到第7d，细菌数达到8.5 Log CFU/mL。而豆蔻精油纳米脂质体对大肠杆菌具有长效抑菌效果，第4d天细菌数抑制在5.5 Log CFU/mL，到第7d 仍然维持在5.0 Log CFU/mL，杀菌率为99.97%。图1b 是豆蔻精油和豆蔻精油纳米脂质体对猪肉中单核细胞增生李斯特菌的杀菌效果，豆蔻精油对单核细胞增生李斯特菌具有良好的抑菌作用，但是也不具长效杀菌效果。而豆蔻精油纳米脂质体对单核细胞增生李斯特菌具有长效抑菌效果，到第7d 仍然维持在5.2 Log CFU/mL， 杀菌率为99.97%。图2是豆蔻精油和豆蔻精油纳米脂质体在鸡肉中对大肠杆菌及单核细胞增生李斯特菌的杀菌作用，同样的，到第5d 精油挥发抗菌效果减弱，而豆蔻精油纳米脂质体的抗菌效果仍然显著，对于大肠杆菌到第7d 仍然维持在5.4 LogCFU/mL，杀菌率为99.84%。对于单核细胞增生李斯特菌到第7d 仍维持在5.3 Log CFU/mL，杀菌率为99.84%。图3 是在牛肉中的杀菌作用，也是到第5d 精油挥发抗菌效果减弱，而豆蔻精油纳米脂质体对于大肠杆菌到第7d 仍然维持在5.1Log CFU/mL，杀菌率为99.95%。对于单核细胞增生李斯特菌到第7d 仍维持在4.9 Log CFU/mL，杀菌率为99.95%。图4是在羊肉中的杀菌作用，豆蔻精油纳米脂质体对于大肠杆菌到第7d 仍然维持在5.1 Log CFU/mL，杀菌率为99.95%。对于单核细胞增生李斯特菌到第7d 仍维持在4.7Log CFU/mL，杀菌率为99.95%。未包埋精油的脂质体不具备杀菌效果，而包埋豆蔻精油的纳米脂质体能够降低精油的不稳定性，起到长效杀菌作用，延长不同肉制品的保质期。

　　图1 豆蔻精油和豆蔻精油纳米脂质体在猪肉中对大肠杆菌（a）及单核细胞增生李斯特菌（b）的杀菌作用

　　3 小结与讨论

　　纳米脂质体作为一种人工细胞膜，不仅可以包埋亲水性或疏水性的物质，其分散性好，安

　　全、无毒副作用，且具有生物相容性。本实验制备的豆蔻精油纳米脂质体可以保护被包埋的豆蔻精油，提高它的稳定性，减少精油的挥发，延长杀菌的作用时效。

　　此外，豆蔻精油纳米脂质体降低了精油的不稳定性，对不同肉制品中的大肠杆菌及单核细胞增生李斯特均有显著的长效杀菌效果。作用7d后细菌几乎均减少了99.9%，能够有效延长食品的保质期。这为以后豆蔻精油在肉制品生产加工中的应用打下了良好的实验基础，为肉制品保鲜保藏提供了新途径。