摘要：以新鲜牛肉为原料，分析不同浓度的Curdlan 及Alcalase对生鲜调理牛肉剪切力、蒸煮损失及感官品质的影响，并研究该体系下肌浆蛋白质及肌原纤维蛋白质的分解情况，优化生鲜调理牛肉嫩化加工工艺。结果表明: 体系中Curdlan对生鲜调理牛肉剪切力、蒸煮损失及感官品质均有显著的影响(P＜0.05) ，但是对牛肉中蛋白质无明显的分解作用;Alcalase 对肌原纤维蛋白质及肌浆蛋白质有明显的分解作用。另外，不同的Curdlan 及Alcalase 添加量对生鲜调理牛肉的剪切力、蒸煮损失均有显著的影响( P＜0.05); 并且Curdlan、Alcalase 对生鲜调理牛肉感官品质有显著的促进作用; 通过响应曲面试验二次回归法优化生鲜调理牛肉工艺，得到工艺条件为Curdlan 添加量5.43mg/g，Alcalase 添加量4.29U/g，腌制时间73.4 h，以该工艺进行验证实验后得到产品剪切力为(0.960 ±0.006)kg，蒸煮损失为(19.96±0.36)%，感官评分为92.81±0.75，与理论值相比，相对误差小于5%，该工艺准确可靠，可以用于生鲜调理牛肉的嫩化加工处理。
关键词: 牛肉; 可得然胶; 碱性蛋白酶; 生鲜; 嫩化; 剪切力; 蒸煮损失
目前中国的牛肉销售仍以冷冻储藏销售和市场开放式的热鲜肉销售为主。调理肉制品是以生鲜肉为主要原料，并加入添加剂、配料及香辛料等，经简单加工后，以包装或散装形式贮存、运输、销售，主要特点是可直接食用或经简单加工、处理就可食用。研究表明，经过诸如香辛料、Nisin、大蒜素等腌制后，可以显著提高牛肉的保鲜期，并对牛肉颜色有显著的保护作用。
可得然胶(Curdlan) 又称为凝胶多糖、卡德兰，是由葡萄糖通过β-l，3-D-葡萄糖苷键形成的多糖类线性大分子，因其来源广泛、使用方便等特性于2006年被卫生部批准为食品添加剂新品种。研究表明，可得然胶可以在pH为3.0～9.5的水溶液中形成可逆的凝胶，通过其呈胶性能可以实现对面粉、肉类、肉糜类的改性。碱性蛋白酶( Alcalase)是一种专一性较弱的内切酶，其作用位点有多种: Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp，可用于肉类蛋白的深度酶解，并已在干腌肉制品中得到了广泛的应用。虽然Curdlan及Alcalase在食品领域中已得到广泛的应用，但是应用于牛肉加工以提高牛肉品质的研究还未见报道。
本研究拟通过不同浓度的Curdlan 及Alcalase 嫩化生鲜调理牛肉，并通过其蛋白质分解特性及质构特性优化加工工艺，以期为生鲜牛肉的发展提供理论依据及技术支持。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
牛肉: 根据GB/T 17238—2008从安徽翰森荷金来屠宰场采样，随机选取9条常规屠宰分割的牛背最长肌，冷却排酸24h后0～4℃冷藏备用;
食盐、料酒、香辛料等；
Alcalase2.4l: 酶活力＞200×104U/g;蛋白质分子量标准: 11～250 kDa；消化片(5.5g硫酸钾和0.5g无水硫酸铜)；可得然胶。
1.2 仪器与设备
速冷冻离心机: Allegra 64Ｒ型;自动凯氏定氮仪: KjeltecTM 2300型; 消化炉: KDN-04型；小型电泳垂直系统: 165-8000型；
智能恒温水浴锅: ZKSY-600型；电子分析天平: AUY120型；紫外—可见分光光度计:UV-2450型。
1.3 方法
1． 3． 1 工艺流程
T1: 原料肉→前处理→Alcalase 与Curdlan 及香辛料等腌制→4℃储藏→成品包装处理
T2: 原料肉→前处理→Alcalase 及香辛料等腌制→4℃储藏→成品包装处理
T3: 原料肉→前处理→Curdlan 及香辛料等腌制→4℃储藏→成品包装处理
T4: 原料肉→前处理→香辛料等腌制→4 ℃储藏→成品包装处理
前处理: 将牛肉清洗后沥干水分，按照长宽厚切成10cm×3cm×1cm的长方体块备用。
Alcalase 腌制: 根据试验设计分别注射质量分数为0.002% Alcalase 酶溶液，通过不同体积注射，使肉块中酶活力单位至试验要求，注射完毕后按摩鸡肉促进酶液均匀扩散。
Curdlan 腌制: 将Curdlan 配制成质量分数为10% 的可逆凝胶，在50℃水浴条件下，初步搅拌3 min后停止，继续加热7 min。取出后冰水冷却，置于4℃冷藏备用。
香辛料添加质量分数: 八角粉0.02%、花椒粉0.001%、小茴香粉0.01%、白芷0.002%、丁香0.002%、甘草0.01%。
1.3.2 Curdlan 协同Alcalase 对调理牛肉的影响
(1)Curdlan 协同Alcalase 对调理牛肉品质的影响:
Curdlan 与Alcalase 按照质量比为4.0mg /g、3U/g，分别按照T1、T2、T3、T4组嫩化生鲜调理牛肉，并分析其在4℃储藏72h后的剪切力、蒸煮损失及感官品质。
（2）Curdlan 协同Alcalase 对调理牛肉蛋白质水解的影响: 分别将Curdlan 与Alcalase 按照表1 添加至各设计处理组中，4℃储藏48h，通过SDS-PAGE 电泳分析其蛋白质变化结果，其中未处理作为对照组。
表1 不同处理组设计
| 处理组 | Curdlan 添加量/(mg·g-1) | Alcalase 添加量/(U·g-1) |
| T1 | 4 | 3 |
| T2 | 0 | 3 |
| T3 | 4 | 0 |
| T4 | 0 | 0 |
1.3.3 生鲜调理牛肉嫩化工艺优化
（1）腌制时间对嫩化效果的影响: 固定Alcalase 添加量为4U/g，Curdlan 添加量为5mg/g，并分析原料肉在4℃储藏24，48，72，96，120h后的剪切力、蒸煮损失及感官品质。其中，对照组为无Alcalase 及Curdlan 添加。
（2） Curdlan 添加量对嫩化效果的影响: 固定Alcalase 添加量为4 U/g，分别用质量分数为0，2，4，6，8，10 mg /g的Curdlan 溶液嫩化原料肉，并分析其在4℃储藏72h后的剪切力、蒸煮损失及感官品质。
（3） Alcalase 添加量对嫩化效果的影响: 固定Curdlan 添加量为5 ng /g，分别用0，1，2，3，4，5，6 U/g的Alcalase 酶解原料肉，并分析其在4℃储藏72h后的剪切力、蒸煮损失及感官品质。
（4）响应曲面试验设计: 采用软件Design Expert 8.0.6( State-Ease，Minneapolis，MN，USA) 中的Box-Behnken 模式进行响应曲面试验设计，以剪切力、蒸煮损失、感官评分为指标，Curdlan 添加、Alcalase 添加及腌制时间作为主要的考察因素( 自变量) 。
1.3.4 指标测定
（1）蛋白组分提取。（2）SDS-PAGE 电泳方法。（3）蒸煮损失测定。（4）剪切力测定。（5）感官评定方法。
1.4 数据统计分析
所有数据利用Microsoft Excel 进行统计处理，用SAS 9.2进行ANOVA 分析，不同平均值之间利用LSD法进行差异显著性检验。用Design Expert 8.0.6 建立响应曲面回归方程，响应曲面试验结果利用最小二乘法进行二次多项式回归统计分析。
2 结果与分析
2.1 Curdlan 协同Alcalase 对生鲜调理牛肉的影响
2.1.1 对牛肉品质的影响由图1可知，与T4相比，添加Curdlan 处理后( T3) ，产品的剪切力呈上升趋势( P＜0.05) ，而经过Alcalase 酶解后牛肉的剪切力显著降低( P＜0.05)( T2) ; 并且Curdlan 及Alcalase 协同处理后( T1) 产品的剪切力略微增加，但是与T2剪切力相比，差异不显著( P＞0.05)。对于蒸煮损失，经过Alcalase 处理后，产品的蒸煮损失呈显著的升高趋势( P＜0.05，而通过T3可以看出，一定的Curdlan可以降低牛肉的蒸煮损失，并且Curdlan 及Alcalase协同处理后，可以显著降低产品的蒸煮损失(P＜0.05) 。原因主要是经过Alcalase 处理后，牛肉中部分肌浆蛋白及肌原纤维蛋白逐渐分解，降低了产品的剪切力，但是由于酶促作用改变了牛肉中原有的保水性，因此，增加了产品的蒸煮损失; 另外，Curdlan 在牛肉中可以形成不可逆的凝胶，一定程度增加了产品的剪切力，达到保水的作用。另外，通过对产品感官评分可以看出，经Alcalase 及Curdlan 处理后( T1) ，产品的感官评分显著高于其余3组( P＜0.05) 。
图1 不同腌制条件对生鲜调理牛肉品质的影响
2.1.2 对蛋白质水解的影响 由图2可知，与对照组相比( T4) ，Alcalase 对肌原纤维蛋白质有明显的分解作用，主要表现为试验组肌原纤维蛋白质在120～200kDa 左右的蛋白条带变暗，70kDa及40～50 kDa 处的蛋白质条带颜色加深( T1、T2)。并且，在T3中可以看出，Curdlan 虽然对肌肉中质构特性有重要作用，但是对于肌原纤维蛋白分解无明显作用。对于肌浆蛋白质，T1、T2中大量大分子蛋白质逐渐分解，并且小分子逐渐累积; 主要表现为在试验组中，85～200kDa的蛋白条带逐渐变暗消失，而30～40kDa 及40～50kDa两处的条带颜色逐渐变深。但是在T3中并无明显的蛋白质分解现象，因此可以看出，仅添加Curdlan 对肌浆蛋白的分解无促进作用。
综合Curdlan 与Alcalase 对牛肉品质的影响结果可以看出，对牛肉蛋白质的存在形式有显著分解作用的主要是Alcalase，而Curdlan 主要是影响牛肉中的质构特性。分析原因: ① Curdlan 本身具有良好的呈胶性能，其螺旋结构可以吸水溶胀，竞争更多水分的同时影响了其余盐离子的活动及蛋白质溶液中原有的非特异结合作用、离子键和氢键;② Alcalase是一种专一性较弱的内切蛋白酶，可能对蛋白质长链中多个位点进行作用而产生小分子蛋白质、肽类等。综上可以得出，Curdlan 与Alcalase 对牛肉蛋白质结构及组成有明显的影响，可以用于生鲜调理牛肉的嫩化。
图2 生鲜调理牛肉蛋白质组分的SDS-PAGE 电泳图谱
2.2 生鲜调理牛肉嫩化工艺优化
2.2.1 腌制时间对生鲜调理牛肉品质的影响 由图3可知，随着腌制时间的延长，产品的剪切力与蒸煮损失变化趋势相似，均呈现在24～72 h时逐渐降低，显著低于对照组剪切力与蒸煮损失( P＜0.05) ，并且对应的产品的感官评分逐渐增加，显著高于对照组( P ＜0.05)；但是随着腌制时间的继续延长(72h后) ，产品的剪切力与蒸煮损失逐渐增加，对应的感官评分逐渐降低。
2.2.2 Curdlan 添加量对生鲜调理牛肉品质的影响 由图4可知，随着Curdlan 添加量的增加，产品的剪切力呈先降低后增加的趋势( P＜0.05) 。由此可知Curdlan 对改善生鲜牛肉的嫩度有重要的作用; 但是，随着Curdlan 添加量的继续增加，导致凝胶能力增强，并且与水结合的能力也逐渐增加，影响了盐离子的活动，从而导致产品剪切力逐渐增加，随着Curdlan 添加量的增加，产品的蒸煮损失逐渐降低，可能是Curdlan 多糖分子能够与水相互作用形成分子内氢键，从而达到降低蒸煮损失的作用。
图3 腌制时间对生鲜调理牛肉品质的影响
图4 Curdlan 添加量对生鲜调理牛肉品质的影响
2.2.3 Alcalase 添加量对生鲜调理牛肉品质的影响 由图5可知，随着Alcalase 添加量的增加，牛肉剪切力显著降低，并且产品的感官评分先增加后降低，在酶添加量为4U/g时产品有较高的感官品质，并且该条件下产品的蒸煮损失显著低于其余水平(P＜ 0.05) 。因此，适当的Alcalase 能够达到嫩化生鲜调理牛肉的目的，但是过高的酶添加量会导致产品品质的降低。
图5 Alcalase 添加量对生鲜调理牛肉品质的影响
2.2.4 响应曲面试验结果 根据单因素试验结果确定试验因素水平设计见表2。表3为不同腌制条件中生鲜调理牛肉品质变化结果。利用Design-Expert 8.0.6 软件对表3试验数据进行二次多项式回归分析，建立以剪切力( Y1) 、蒸煮损失( Y2) 、感官评分( Y3) 对3个响应因素的二次多项式的回归方程:
Y1= 5.48－0.79X1－0.75X2－0.02X3+0.04X1X2+4.51× 10-4X1X3+2670X2X3+0.05X21+ 0.04X22+4.68×10-5 X23， （1）
Y2=194.68－20.14X1－28.81X2－1.42X3－0.56X1X2+0.03X1X3+0.05X2X3+1.59X21+3.28X22+ 7.53×10-3 X23 （2）
Y3=-201.45+42.91X1+57.51X2+1.68X3－3.82X1X2－0.06X1X3－0.06X2X3－2.34X21－3.73X22－7.48×10-3X32。 （3）
为了验证建立的回归模型是否显著，对模型进行方差分析，结果见表4。表4中结果表明，3个回归模型的显著性( F 检验) 检验结果极显著( P＜0.01) 、失拟性检验结果均不显著( P＞0.05) ，说明试验中优化的二次模型能够拟合真实的试验结果。另外，3个二次模型决定系数( Ｒ2 ) 与模型校正决定系数( Ｒ2Adj) 均大于0.9，并且模型信噪比均大于临界值4。综上结果，说明3个模型拟合效果良好，试验误差小，可信度高。因此试验中模型可以用于生鲜调理牛肉工艺优化。
表2 试验自变量因素编码及水平
| 因素水平 | X1Curdlan 添加 量/( mg·g-1) |
X2Alcalase 添加 量/( U·g-1) |
X3腌制时间/h |
| -1 | 4.0 | 3 | 48 |
| 0 | 5.5 | 4 | 72 |
| 1 | 7.0 | 5 | 96 |
表3 响应曲面试验结果
| 序号 | X1 | X2 | X3 | 剪切力/kg | 蒸煮损失/% | 感官评分 |
| 1 | 0 | 1 | -1 | 0.969 | 23.69 | 87.66 |
| 2 | 1 | 1 | 0 | 1.201 | 19.37 | 74.66 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0.979 | 19.87 | 92.65 |
| 4 | 1 | 0 | -1 | 1.179 | 22.63 | 81.56 |
| 5 | 0 | -1 | 1 | 0.961 | 28.89 | 83.66 |
| 6 | 0 | -1 | -1 | 1.169 | 30.05 | 78.63 |
| 7 | -1 | 1 | 0 | 1.036 | 30.66 | 94.68 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 0.957 | 20.05 | 93.06 |
| 9 | 0 | 1 | 1 | 1.017 | 27.58 | 86.79 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 0.961 | 19.46 | 91.16 |
| 11 | -1 | -1 | 0 | 1.179 | 32.55 | 80.38 |
| 12 | -1 | 0 | -1 | 1.151 | 31.89 | 81.66 |
| 13 | 1 | -1 | 0 | 1.077 | 24.61 | 83.25 |
| 14 | 1 | 0 | 1 | 1.109 | 25.87 | 79.58 |
| 15 | -1 | 0 | 1 | 1.016 | 31.03 | 87.86 |
表4 回归模型系数显著性检验
| 来源 | 剪切力 | 蒸煮损失 | 感官评分 | |||
| F值 | P值 | F值 | P值 | F值 | P值 | |
| 模型 | 33.03 | ＜0.0001 | 83.79 | ＜0.0001 | 23.07 | 0.0002 |
| X1 | 9.36 | 0.0184 | 2.77.41 | ＜0.0001 | 29.74 | 0.0010 |
| X2 | 7.34 | 0.0302 | 53.66 | 0.0002 | 14.57 | 0.0066 |
| X3 | 36.82 | 0.0005 | 6.40 | 0.0393 | 3.20 | 0.1166 |
| X1X2 | 39.41 | 0.0004 | 5.50 | 0.0515 | 47.82 | 0.0002 |
| X1X3 | 2.34 | 0.1703 | 8.24 | 0.0240 | 6.11 | 0.0428 |
| X2X3 | 36.23 | 0.0005 | 12.50 | 0.0095 | 3.18 | 0.1179 |
| X12 | 136.75 | ＜0.0001 | 105.94 | ＜0.0001 | 42.43 | 0.0003 |
| X22 | 12.37 | 0.0098 | 88.81 | ＜0.0001 | 21.43 | 0.0024 |
| X23 | 6.76 | 0.0354 | 155.30 | ＜0.0001 | 28.57 | 0.0011 |
| 失拟项 | 6.50 | 0.0512 | 6.25 | 0.0544 | 4.53 | 0.0892 |
| 标准差 | 0.021 | 0.710 | 1.660 | |||
| R2 | 0.977 | 0.991 | 0.967 | |||
| Adj-R2 | 0.947 | 0.979 | 0.926 | |||
由表4可知，各二次项对结果均有显著的影响；在交互项中可以得出，对于剪切力，Alcalase 添加量与Curdlan 添加量及腌制时间之间对产品剪切力均有显著的交互作用；对于蒸煮损失，腌制时间与Alcalase 添加量及Curdlan 添加量之间有显著的交互作用; 对于感官评分，Curdlan 添加量与腌制时间及Alcalase 添加量之间有显著的交互作用，具体分析如下。
2.2.5 试验因素交互作用分析
图6 不同因素间对生鲜调理牛肉剪切力的交互作用影响
图7 不同因素间对生鲜调理牛肉蒸煮损失的交互作用影响
图7 不同因素间对生鲜调理牛肉蒸煮损失的交互作用影响
（1）不同条件对小块牛肉剪切力的影响: 由图6(a) 可知，在固定腌制时间为72h时，随着Alcalase 添加量的增加，影响产品剪切力的Curdlan 添加量的临界值( 最适添加量) 呈上升趋势，并且该条件下产品的剪切力临界值呈先降低后升高的趋势。主要原因是随着酶添加量的增加，部分蛋白质逐渐分解，牛肉中蛋白质水解指数及肌纤维小片化指数逐渐增加，从而降低了产品的剪切力。当固定Curdlan 添加量时，Alcalase 添加量与腌制时间对剪切力也存在交互作用，并且从图6(b)中可以看出，在腌制时间为70～80h 时，剪切力存在临界值；在该范围内，随着Alcalase 添加量的增加，该临界值逐渐降低。由此可以看出，在生鲜牛肉调理过程中，不同的因素对肌肉环境有复杂的交互作用，通过对交互作用分析对优化调理工艺有重要的作用。
（2）不同条件对小块牛肉蒸煮损失的影响: 由图7可知，在固定Curdlan 添加量为5.5mg/g时，随着腌制时间的延长，不同Alcalase 添加量对蒸煮损失影响的临界值呈先降低后升高的趋势，在腌制72h左右出现临界值；主要是不同Alcalase 条件下，随着腌制时间的延长，对肌肉蛋白质作用结果也不尽相同，从而影响了产品的保水性及小分子的溶出。另外，不同Curdlan 添加量与腌制时间对蒸煮损失的交互作用影响与其相似，也呈现随腌制时间的延长，不同Curdlan 添加量对蒸煮损失影响的临界值呈先降低后升高的趋势。主要是因为在肌肉中Curdlan 形成稳定凝胶后，对肌肉蛋白质分子形成包埋作用，造成蛋白质的疏水性增强，从而影响了产品的蒸煮得率。
（3）不同条件对小块牛肉感官品质的影响: 由图8可知Curdlan 添加量是影响产品感官品质的最主要的指标，在不同条件下，随着Curdlan 添加量的增加，产品的感官品质呈先增高后降低的趋势; 固定腌制时间为72h 时，随着Alcalase添加量的增加，影响产品感官品质的Curdlan 添加量的临界值呈上升趋势，该结果与剪切力分析结果中趋势一致，该条件中产品感官评分的临界值呈先增加后降低的趋势。另外，在固定Alcalase 添加量为4U/g时，由于Curdlan 在肌肉中的呈胶能力不断改变，导致随着腌制时间的延长，产品的感官品质呈先升高后降低的趋势。
图8 不同因素间对生鲜调理牛肉感官评分的交互作用影响
2.2.6 工艺优化 本次试验以感官评分最大值、剪切力及蒸煮损失最小值为目标值，利用Design-Expert 软件自带的结果优化程序对生鲜调理牛肉工艺进行优化，得到优化后的工艺条件为Curdlan 添加量5.43 mg /g，Alcalase 添加量4.29 U/g，腌制时间73.4h，该条件下的预测值为剪切力1.0 kg，蒸煮损失19.96%，感官评分92.81，以该工艺进行验证实验后得到产品剪切力为( 0.960±0.006) kg，蒸煮损失为( 19.96±0.36) %，感官评分为92.81±0.75(n=3)。相对误差小于5%，因此该工艺准确可靠，可以用于生鲜调理牛肉的嫩化加工处理。
3 结论
本研究结果说明，Curdlan 与Alcalase 对生鲜调理牛肉品质有明显的促进作用，Alcalase 对肌原纤维蛋白质及肌浆蛋白质有明显的分解作用，而Curdlan 对肌浆蛋白及肌原纤维蛋白质均无明显的分解作用。Curdlan 及Alcalase不同的添加量对生鲜调理牛肉的剪切力、蒸煮损失均有显著的影响(P＜0.05)；并且Curdlan、Alcalase 对生鲜调理牛肉感官品质有显著的促进作用。本研究优化的工艺准确可靠，可以用于生鲜调理牛肉的嫩化加工处理。
