摘要：随着生命科学与生物技术的快速发展，国际上农畜产品安全检测技术正在向着检测方法与技术的通量化、快速化、自动化和智能化等方向发展。而免疫检测方法由于其具有特异性和灵敏性、其试剂具有稳定性、操作具有简便性，因此适合推广应用。其中蛋白芯片法与传统酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）方法比较，具有高通量，样品用量少，一份样品可同时进行多指标分析，大大降低了检测的成本，提高了检测的效率，并且检测限与灵敏度等均与ELISA方法相当。动物源性食品种类和成分较为复杂，目标化合物的检测限较低，各目标化合物的性质差异大，且可能同时存在多种组分。因此，近年来蛋白芯片在食品安全检测等领域的应用也日渐增多。本文就蛋白芯片技术在食品安全检测中的应用进行综述，以期为食品安全现场快速检测提供参考。
关键词：蛋白芯片；食品安全检测；综述
1 引言
20世纪80年代末以来，由于一系列食品原料的化学污染、畜牧业中抗生素的应用、基因工程技术的应用，使食品污染导致的食源性疾病呈上升趋势，食品安全问题为全世界所关注。现场的食品快速检测方法要求实验准备简化，使用的试剂较少，配制好的试剂保存期长；样品前处理简单，对操作人员要求低；分析方法简单、准确和快速。化学比色法、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫胶体金试纸法是目前应用比较成熟的现场快速检测方法。随着食品安全相关检测装备的进步，食品安全检测车的出现，一些新的现场快速检测技术得以应用，如蛋白芯片技术的加入为现场检测提供了更广阔的发展空间。本文就蛋白芯片技术在食品安全检测中的应用进行综述，以期为食品安全现场快速检测提供参考。
2 蛋白芯片概述
蛋白芯片技术是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法，它是在基因芯片的基础上发展起来的。蛋白芯片技术主要采用微阵列点样等方法将大量生物大分子如抗原或抗体等样品有序地固定在玻片、膜、硅胶片、多孔板等支持物的表面，组成密集的二维分子阵列，然后与标记的待测生物样品中的靶分子实现特异性反应，反应结果用化学发光法、荧光法、酶催化底物显色法、同位素法等方法显示，最后通过特定的仪器对信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，并进行数字化处理提供定性和定量分析结果，判断样品中靶分子的含量，从而达到分析检测的目的。
蛋白芯片技术不仅适用于大分子化合物（如蛋白质、核酸、细菌）的检测，也适用于小分子化合物（如抗生素、激素等）的测定。蛋白芯片法与传统ELISA方法比较，具有高通量，样品用量少，一份样品可同时进行多指标分析等优势，大大降低了检测的成本，提高了检测的效率，并且检测限与灵敏度等均与ELISA方法相当。动物源性食品种类和成分较为复杂，目标化合物的检测限较低，各目标化合物的性质差异大，且可能同时存在多种组分。因此，近年来蛋白芯片在食品安全检测等领域的应用也日渐增多。
3 蛋白芯片在食品安全检测中的应用
蛋白芯片分析方法在食品中的农兽药残留、生物毒素残留、食源性致病微生物及转基因食品的检测等方面具有巨大的应用潜力，具有使用样品体积少，不需要复杂的样品预处理，并且高通量和快速等特点。
3.1 在农兽药残留检测中的应用
在食品安全检测中，农兽药残留检测是非常重要的一个环节。在实际生产过程中，快速筛选方法比实验室中确证的定量分析更具有实际意义，而蛋白芯片具有高通量、快速的检测特点正适用于大规模生产中的快速筛选。Knecht等在硅烷化修饰的片基上制备10种抗生素抗原点阵，包括β-内酰胺类、磺胺类及氨基糖苷类等，通过化学发光法检测牛奶中抗生素残留含量。整个检测过程只需5min，且实现了自动化。Kloth等建立的蛋白芯片间接竞争化学发光免疫法，能在几分钟内同时定量检测牛奶中磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等13种抗生素含量。该方法灵敏度较高，但化学发光的检测设备较昂贵，很难在基层推广应用。刘楠等建立了一种高通量悬浮蛋白芯片检测方法，将方法首先应用于氯霉素和克伦特罗两种兽药残留的同时高通量检测，此后应用于氯霉素、克伦特罗、雌二醇、泰乐菌素4种兽药和阿特拉津、吡虫啉、甲萘威3种农药的同时检测，整个检测过程只需1～2h，可满足多种农兽药残留检测的灵敏、特异、快速和高效的需求。左鹏等报道了一种基于载玻片的荧光免疫微阵列蛋白芯片法，用于同时检测食品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶2种抗生素残留，以及牛奶中磺胺二甲嘧啶、链霉素和泰乐菌素3种抗生素的含量，该方法简单、快速、灵敏度高、可满足大量样本快速初筛，检测限均低于国家规定的最大允许残留量。Liu等用荧光免疫微阵列蛋白质芯片法同时测定鳗鱼中孔雀石绿、己烯雌酚、甲羟孕酮和3-氨基-2-恶唑烷酮的含量。并将该蛋白质微阵列方法与用于这四种分析物的市售试剂盒进行比较，两种方法的结果一致。Raz等描述了基于表面等离子体共振的免疫传感器建立了牛奶中氨基糖苷类（新霉素、庆大霉素、卡那霉素和链霉素），磺胺类（磺胺二甲嘧啶），氯霉素类（氯霉素）和氟喹诺酮类（恩诺沙星）残留物的无标记多重检测系统。多重残留的检测可用于测量μg/L水平的所有目标化合物，其对于欧盟确定的最大允许残留水平的牛奶控制足够敏感。本实验室基于可视化微孔板芯片开发了多种检测方法，实现了同时检测牛奶中庆大霉素，牛奶中磺胺类和喹诺酮类，牛奶中诺氟沙星和恶喹酸，牛奶中黄曲霉毒素，头孢氨苄，三聚氰胺，以及蜂蜜中四环素，蜂蜜中4种硝基呋喃代谢物的同时检测，检测灵敏度高，可满足高通量快速检测需求。此外，基于智能手机可视化微孔板芯片同时检测牛奶中喹诺酮类和四环素类抗生素残留检测，实现单孔定量检测。目前蛋白芯片法检测各种残留物为食品生产企业对产品出厂的把关，以及相关部门对食品质量安全的快速抽查提供了技术支持。
3.2 在生物毒素残留检测中的应用
在过去的几十年里，农业食品系统中的霉菌毒素污染一直是全球的一个严重问题。真菌毒素是真菌在农产品和饲料中生长时产生的有毒次生代谢产物。近年来开发了多种霉菌毒素的检测技术，基于免疫的蛋白芯片检测方法由于其灵敏度高和检测时间短而得到了广泛应用。Wang等开发了一种免疫芯片，可在4h内同时定量检测水中黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素M1，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，猪曲霉毒素A，T-2毒素和玉米赤霉烯酮6种霉菌毒素的浓度，具有使用样品量少和肉眼可视半定量的优点。Hu等研究了一种基于无污染聚合物刷的荧光竞争免疫测定微阵列用于黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）多种真菌毒素的灵敏检测，检测限分别为4，4和3pg/mL，并且与常规ELISA方法相当或甚至更好。Li等基于表面增强拉曼散射（surface enhanced Ramanscattering，SERS）的免疫传感器被开发用于检测食品中的3种真菌毒素（AFB1、ZEA、OTA）。测定的检测限AFB1为0.061～0.066μg/kg，ZEA为0.53-0.57μg/kg，OTA为0.26-0.29μg/kg。Wang等使用3D等离子体纳米柱阵列的表面增强拉曼散射对多种霉菌毒素（OTA、伏马菌素B（Fumonisin B，FUMB）和AFB1）进行免疫分析。对于OTA、FUMB和AFB1，检出限（limit of detection，LOD）被确定为5.09、5.11、6.07pg/mL。Pagkali等（321介绍了一种无标记的光学生物传感器，用于快速同时测定啤酒样品中的黄曲霉毒素B1（AFB1），伏马菌素B1（fumonisinsB1，FB1）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）3种霉菌毒素。AFB1、FB1、DON的检测限分别为0.8、5.6、24ng/mL，而检测时间仅为12min。表面等离子体共振成像（surface plasmon resonanceimaging，SPRi）是无标记，实时和高通量免疫测定的强大工具，但其灵敏度需要必要的改进。Wei等到报道了单层石墨烯涂层金芯片可以有效地增强表面等离子体共振（surface plasma resonance，SPR）的灵敏度。以抗玉米赤霉烯酮（ZEN）为研究对象，结果表明检测信号可以增强40%。Schulz等基于电化学生物芯片用于快速和便携式自动化现场检测蛤蚌毒素，T-2毒素以及黄曲霉毒素M1及其相应的同源物等低分子量毒素，能够在17min内检测到ng/mL水平。Beloglazova等使用基于量子点（quantum dot，QDs）的免疫化学技术开发了多重荧光免疫吸附测定（fluorescence immunosorbent assay，FLISA）方法。使用基于直接竞争性免疫测定法同时检测ZEA和AFB1，检出限为1.8和1μg/kg。
3.3 在食源性致病微生物检测中的应用
食源性致病微生物是食源性流行病的原因，因此需要迅速检测食品中的病原体。在琼脂平板上接种进行预富集培养是标准检测方法，qPCR的分子检测方法实现了24h内检测病原体。此外，生物传感器可以在富集培养早期实现快速检测。Magliulo等已经开发了一种简单快速的多重夹心化学发光酶免疫测定法，用于同时检测大肠杆菌0157：H7（Escherichia coli O157：H7）、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌。为了实现4种病原体的多重检测，设计了一种新的聚苯乙烯96孔微量滴定板形式，其中每个主要孔在底部包含4个子孔。对每种细菌特异的单克隆抗体分别固定在每个子孔中。当将样品加入主孔中时，能够特异性结合相应单克隆抗体的细菌被捕获在4个子孔中的一个。随后，加入针对4种细菌的过氧化物酶标记的多克隆抗体混合物，并使用基于鲁米诺的化学发光法进行检测。该测定简单快速，所有细菌种类的定量限为104～105CFU/mL。通过将结果与常规培养方法进行比较来评估该方法的准确性，结果令人满意，回收率为90%～120%。该方法可用作筛选试验，以评估这些病原菌在不同食品中的含量。熊亮斌等在硝酸纤维素膜上制备的可视化蛋白芯片，可检测西瓜中果斑病菌，具有较好的特异性和重复性。与酶联免疫吸附法（ELISA）相比，可视化蛋白芯片的检测灵敏度和阳性检出率均相当，但检测时间更短，仅为ELISA法的八分之一，所需检测样本量更少，结果肉眼可视等优点。胡娟等也在硝酸纤维素膜上制备的可视化蛋白芯片，用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测，以50批葫芦科种子为样品，对可视化蛋白芯片检测与ELISA检测结果进行了比较，其检测结果吻合率达98.0%，经PCR检验，检测结果一致性良好。说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测。Palmiro等刚开发并测试了一种蛋白质芯片，用于筛选和鉴定5种常见病原体，包括沙门氏菌，大肠杆菌（E. coli），金黄色葡萄球菌，弯曲杆菌和李斯特菌，该蛋白质芯片在病原体鉴定中具有高度特异性，可以快速，可靠地筛选出污染食品中这5种常见病原体。
3.4 在转基因食品检测中的应用
随着全球转基因技术的迅猛发展，研究人员利用转基因技术培育出了抗除草剂、抗重金属、抗病虫害、抗干旱、耐盐碱和营养价值高的品种，这对于提高产量、减少损失以及增加农产品营养价值具有重要作用。然而转基因作物在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性及对生态环境的安全性方面。因此世界各国都在加强对转基因食品的管理。蛋白芯片法可以检测出转基因食品中外源基因表达出来的蛋白质，汪琳等研制了一种蛋白芯片可同时检测3种转基因成分表达的BTCry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、BTCrylAh蛋白。将3种蛋白质所对应的单克隆抗体点于环氧基修饰的片基上，其检测灵敏度分别为：BTCry1Ac蛋白35ng/mL、植酸酶蛋白20ng/mL、BTCry1Ah蛋白30ng/mL，具有较高的灵敏度、特异性和可靠性。
3.5 在动物疫病检测中的应用
病毒感染是全世界畜禽养殖场发病率的主要原因。血清学检测技术包括血细胞凝集抑制（hemagglutination inhibition，HI）、琼脂凝胶沉淀素（AGAR gel precipitin，AGP）测试、免疫荧光测定（immunofluorescence assay，IFA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等。虽然这些方法的价值和重要性是显而易见的，但它们不能同时进行检测。蛋白芯片法可同时检测多个血清样品中的抗体。石霖等利用可视化蛋白芯片法对禽流感、新城疫2种禽病血清抗体和禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和传染性法氏囊病4种禽病血清抗体同时检测。该芯片具有快速、简便、灵敏、特异性的特点，无需特殊仪器，成本低。血清样品检测可信度高，且灵敏度高于琼脂扩散实验，可推广到基层使用。Wang等开发了一种可视化蛋白芯片可以同时检测禽流感病毒，新城疫病毒，传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊病病毒诱导的抗体。与传统方法相比，该蛋白芯片显示出良好的灵敏度，是琼脂凝胶沉淀法的400倍以上，且相互之间无交叉反应。Sheng等制备的琼脂糖凝胶蛋白芯片，实现了对鱼淋巴囊肿病毒的检测。通过优化琼脂糖凝胶基片表面的化学结构和检测抗体的标记物等，实现鱼淋巴囊肿病毒的最低检测限为0.0686μg/mL，与酶联免疫吸附测定（ELISA）的一致率为100%，免疫荧光测定技术的一致率为98%。赵玉辉等建立一种检测A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）抗体的蛋白芯片，利用蛋白芯片分别对15个亚型流感病毒免疫血清、SPF鸡血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和现地血清样品进行检测，通过与血凝抑制试验比较，表明建立的蛋白芯片方法具有良好的灵敏性和特异性，为AIV抗体检测及制备检测AIV不同亚型或多种病原抗体的蛋白芯片提供方法。顾大勇等将禽流感病毒H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2、NP、NS1等9种亚型抗原以最佳浓度，点样于玻璃载体表面，构建相应抗体的检测芯片，分别用于禽类不同类型禽流感病毒血清及随机选择的人血清检测，并对特异性、敏感性及重复性进行测试，与血凝抑制法进行双向验证比较，结果一致。刘志玲等建立了牛地方流行性白血病的液相蛋白芯片检测方法，检测结果与ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.6%，为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。曾梦等建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的荧光微球免疫学检测方法，纪方晓等建立了猪戊型肝炎病毒液相蛋白芯片检测方法，方法与商品化ELISA试剂盒检测结果一致，为建立猪病多重检测方法提供了基础。
4 总结与展望
已报道的蛋白芯片方法相比于传统的检测方法如色谱-质谱联用等技术虽有多靶标、快速、高灵敏度等优点，但是存在诸如检测仪器复杂、价格昂贵、操作繁琐、通量低等问题，不适合在基层检测机构和小的食品生产企业推广应用。本课题组建立的基于可视化蛋白芯片的检测方法，可同时检测多种药物及有害物残留引和同时检测多种营养蛋白质的含量。与传统生物芯片相比，具有可视化，可直接用肉眼观察芯片结果，无需使用昂贵的荧光或化学发光检测设备。可视化生物芯片摆脱了昂贵的生物芯片分析仪器，大大降低了检测成本，提高了可操作性、应用性和推广性。
