摘要：为研究不同包装方式对冷鲜鸡肉贮藏期间菌群组成的影响，本文利用Illumina MiSeq高通量测序分析了不同包装方式下的微生物多样性。结果表明，在4℃冷藏期间，MAP，VP和N2包装能显著降低微生物数量和挥发性盐基氮含量。高通量测序表明冷鲜鸡肉贮藏初期菌种丰富度高，贮藏后期优势菌属逐渐演变为假单胞菌属、环丝菌属、不动杆菌属和希瓦氏菌属，说明它们能耐受较低的温度。与PP组相比，MAP组假单胞菌属和不动杆菌属的丰度分别降低14.8%和9.2%，而N2组不动杆菌属和希瓦氏菌属的丰度分别降低9.6%和7.4%。VP组不动杆菌属、环丝菌属丰度下降8%和5.6%。不同包装方式对冷鲜鸡肉中的菌群影响较大，三种包装均能抑制不动杆菌属的生长，气调包装对假单胞菌属抑制效果较好，而充氮包装和真空包装对希瓦氏菌属和环丝菌属有较好的抑制效果，本研究也为未来冷鲜鸡肉所采用的包装方式提供理论基础。
关键词：冷鲜鸡；气调包装；充氮包装；真空包装；微生物多样性
鸡肉是人们餐桌上的食用佳品，其营养价值高，风味独特，脂肪含量低，是全球销售量最大的肉类之一。但是由于肉类的水分含量高、营养成分丰富等因素，为微生物快速繁殖提供了有利条件。特别是具有高腐败潜力的细菌的生长繁殖，可对肉类和肉制品产生有害影响，例如变色、产生难闻气味和粘液。通常托盘包装、气调包装、充氮包装和真空包装等结合低温处理的贮藏方式，是保存冷鲜鸡肉的重要方法。因为它不仅可以抑制优势腐败微生物的生长，还可以改善肉制品的品质和色泽。高磊等研究发现气调包装能明显抑制冷鲜鸡中微生物的生长繁殖，提高产品品质。
但是腐败微生物群落的整体组成是多种多样的，主要由肉类所贮藏的环境决定的。细菌种群组成与使用不同的包装方式贮藏有关。因此确定贮藏期间的微生物菌群是十分有必要的。赖宏刚等发现真空包装冷鲜鸡中腐败菌微生物以假单胞菌属、乳酸菌属、环丝菌属等为主。Liang等在托盘包装的鸡肉产品中检测到不动杆菌属、假单胞菌属、肉芽孢杆菌属、魏斯氏菌属等细菌。Huang等通过检测常温和气调包装鸡肉中细菌群落的动态变化，发现贮藏7 d后，假单胞菌属迅速繁殖并成为主要腐败生物，相对丰度占整个菌群的90%以上。
虽然已有关于不同包装方式对冷鲜鸡微生物菌群影响的研究，但是其未对不同包装方式进行系统的比较。另外，以传统的培养方法评估微生物多样性局限性太大，随着高通量测序技术的发展，利用16S rDNA的高通量测序研究微生物菌群越来越受到关注，高通量测序技术已成为微生物群落动态分析的常用研究工具。因此本研究以冷鲜鸡肉为研究对象，研究冷鲜鸡肉在不同包装条件下的保鲜效果，同时使用16S rDNA的高通量测序研究冷鲜鸡肉贮藏前期和后期微生物菌群的变化规律。研究结果将为食品行业在延长冷鲜鸡肉货架期提供理论信息。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒；平板计数琼脂培养基、氯化钠、碳酸钾；脂糖、FastPfu Taq酶（100 U）；硼酸；阿拉伯胶；甲基红指示剂、次甲基蓝指示剂；鲜鸡胸肉。
SH-450立式气调包装机；GI100T高压灭菌锅；B1-150A生化培养箱。
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备 冷鲜鸡胸肉从南京某商超购买，并立即将其放在4℃的恒温冰盒中1 h内送到实验室。将所有鸡胸肉以100 g一份无菌分装为四组，每组三个平行，放进18 cm×10 cm×5.5 cm的聚丙烯食品级无菌包装盒中，按照实验要求分批进行托盘包装（PP）、气调包装（MAP，80%N2/20%CO2）、真空包装（VP，VAC≥600～1333 Pa）和充氮包装（N2，N2≥99.9%）。然后分别放入在4℃的冰箱中冷藏贮存7 d。收集样品进行菌落总数计数、总挥发性盐基氮测定并提取微生物基因组DNA并进行多样性分析。
1.2.2 菌落总数计数 将指定的样品（10 g）放入含有90 mL 0.85%无菌生理盐水的均质袋中，并在袋中均质2 min。根据实验需要，匀浆被适当地连续梯度稀释，然后将0.1 mL适当稀释液的等分试样一式三份分布在平板计数琼脂培养基上。在37℃下培养48 h后对总活菌数（TVC）进行计算。
1.2.3 总挥发性盐基氮（TVB-N）将10 g碎鸡肉样品放入装有90 mL蒸馏水的三角形瓶中，然后摇晃30 min。此后，使用定性滤纸过滤所得样品。最后按照国标方法（GB 5009.228-2016）测定TVB-N含量。
1.2.4 DNA提取 使用细菌基因组提取试剂盒从不同处理组的冷鲜鸡样品中提取总菌的基因组DNA。对上述获得的DNA都要进行完整性和纯度分析的工作，确保其DNA满足后续的操作要求。此步骤利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的质量检测和浓度量化。
1.2.5 PCR扩增 利用引物（338F：ACTCCTACGGG AGGCAGCA和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增16S rDNA基因的V3～V4区可变区。PCR扩增体系（20 μL）和反应程序按照FastPfu Taq酶的说明书进行。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，利用凝胶回收试剂盒回收目标片段。
1.2.6 测序和数据分析 来自每个样品的 PCR产物送至奥维森公司基因科技有限公司利用IlluminaMiSeq300进行测序和分析。使用QIIME软件分析测序数据，以细菌序列相似性至少为97%的操作分类单元（OTU）为标准，从原始数据中进行读取后，进行筛选，质量过滤，修剪掉低质量序列，嵌合体检查等一系列工作。基于OTU聚类结果利用Mothur软件进行Alpha多样分析。使用R语言工具统计和作Veen，主成分分析图和生成热图。
1.3 数据处理
使用SPSS软件进行结果进行统计分析。所有分析均使用最小显着性差异（LSD）方法检验，显着性水平为0.05。所有结果均以“平均值±标准差”表示。使用R语言进行PCA 统计、分析和作图。
2 结果与分析
2.1 不同包装条件下细菌总数和挥发性盐基氮变化
细菌生长是导致贮藏过程中肉质腐败的重要因素。本文分析了不同包装方式下冷鲜鸡的TVC和TVB-N的变化情况。冷鲜鸡样品的平均初始TVC水平为4.17 lg CFU/g。在冷鲜鸡的整个贮藏期内，TVC逐渐增加，至第7 d时，PP组为7.02 lg CFU/g，而MAP、N2和VP组分别为6.31、6.35和6.62 lg CFU/g，它们都显著低于PP组（P＜0.05）。结果表明，与PP组相比，MAP、N2和VP组都可以抑制冷鲜鸡样品中微生物的生长。
注：MAP：气调包装样品；N2：充氮包装样品；VP：真空包装样品；PP：托盘包装样品 ；不同大写字母表示同一包装方式下不同贮藏天数的显著性差异（P＜0.05）；不同小写字母表示同一贮藏天数下不同包装方式间显著性差异（P＜0.05）。
TVB-N常被用作反映肉类新鲜度的主要指标，是微生物生长的化学腐败指标。因此，可以根据TVB-N来判定冷鲜鸡是否符合食品标准。图1显示了新鲜样品的TVB-N的初始值为8.16 mg N/100 g。除PP组外，其他样品中的TVB-N值在贮藏前3 d增加较少。此后直至贮藏后期，TVB-N值迅速增加。第7 d时，PP组的TVB-N值达到28.9 mg N/100 g。MAP、N2和VP处理组的TVB-N分别为15.87、23.33和25.67 mg N/100 g，显著低于PP组（P＜0.05）。根据国家标准GB 5009.228-2016规定，鸡肉中的TVBN的含量不得超过25 mg/100 g。因此，MAP、N2处理组都可以延缓冷鲜鸡的腐败变质，将货架期延长至7 d以上。上述TVB-N含量的变化规律与Yang等的研究相似。TVB-N在每个样本中随着贮藏时间的增加而增加，TVB-N持续增加表明储存期间冷鲜鸡肉品质的持续恶化。TVB-N的增加主要与肉糜和内源酶引起的蛋白质降解反应有关，包括游离氨基酸的脱氨和脱羧、氧化物的降解和胺的氧化。这种现象归因于适宜的环境有利于腐败菌群繁殖。
2.2 操作分类单元（OTU）的表征
注：CS：第0 d的对照样品；MAP：第7 d气调包装样品；N2：第7 d充氮包装样品；VP：第 7 d真空包装样品；PP：第7 d托盘包装样品；表1，图3～图5同。
16S rDNA基因扩增子测序可以深度分析冷鲜鸡微生物群落的多样性和丰度。高通量测序会产生一系列错误或有问题的序列。为了确保结果的可靠性，经过质量过滤和组装，从总共15个样本里得到311280个有效序列，优质序列主要以在400～440的区间长度为主。这些序列按照97%的序列相似度聚类成OTU，共产生851个OTU，经过处理后剩余804个。Venn图（图2）显示了不同组的OTU分布。在CS、PP、MAP、N2和VP组中分别有598、466、532、503和455个OTU，共有的OTU为57个，说明不同包装方式处理冷鲜鸡微生物群落差异较大。
2.3 不同包装方式对冷藏鸡储存后期的微生物多样性的影响
2.3.1 alpha多样性 通过高通量测序确定不同处理的微生物群组成（表1）。可以看出所有组的覆盖率＞0.99，这意味着在样本中检测到几乎所有微生物系统类型。通过使用相同的样本分析α多样性来表征冷藏鸡肉在储存期间微生物群的变化。而Shannon和Simpson指数则代表了物种存在的丰度和均匀度。贮藏至第7 d时，冷鲜鸡肉的微生物组中的Shannon和 Simpson指数均显著低于0 d（P＜0.05）。这与Jia等的其他研究一致。这可能是因为随着贮藏时间的延长，冷鲜鸡中的少数优势腐败菌快速生长，在这种高度竞争的环境下，部分微生物菌群遭到淘汰。此外，优势细菌与其他细菌的竞争性生长也导致这些样本的多样性降低。
Shannon和Simpson多样性指数差异不大。这可能是因为气调包装、充氮包装或真空包装仅对样品中的部分优势腐败菌有抑制效果，但微生物种类的数量变化不显著，因而物种多样性仍比较接近。
2.3.2 细菌群落组成
2.3.2.1 科水平 在科水平上，样品中细菌群落的组成在贮藏过程中经历了显著的波动。从图3A中可以看出，在贮藏初期，冷鲜鸡肉新鲜度较高，菌群多样性较高，假单胞菌科所占的比例较小。优势菌科依次为莫拉菌科，黄杆菌科和威克斯氏菌科。不同时期的科分布差异巨大。贮藏到第7 d，在PP组中，假单胞菌科的丰度为25.46%。李斯特菌科为24.23%。莫拉菌科为22.4%。希瓦氏菌科为12.27%。在N2组中，假单胞菌科的平均丰度百分比为41.69%，李斯特菌科为31.15%，莫拉菌科为13%，希瓦氏菌科为4.83%。在VP组中，假单胞菌科的丰度为41.6%，李斯特菌科为18.6%，莫拉菌科为14.4%，希瓦氏菌科为9.8%。MAP组以李斯特菌科和希瓦氏菌科为主要的两个科，分别占总科数的38%和13.6%。
2.3.2.2 属水平 在属的水平上，新鲜鸡肉中微生物种群的主要组成部分包括不动杆菌属，黄杆菌属，金黄杆菌属。4个处理组经过7 d贮藏后，冷鲜鸡肉中都能发现不动杆菌属。在贮藏后期，优势菌属较贮藏初期有较大差别，黄杆菌、金黄杆菌属逐渐被假单胞菌属、环丝菌属和希瓦氏菌属取代。在贮藏后期，这些优势菌属在冷鲜鸡样本中的占比超过群落总数的70%，最高可超过80%。有报告发现，假单胞菌属，希瓦氏菌属和不动杆菌属是肉中最常见的腐败菌属。其中，PP组假单胞菌属、环丝菌属、不动杆菌属、希瓦氏菌和沙雷氏菌属剧增至25.45%、24.22%、22.24%、12.27%和6.18%成为优势菌。相较于PP组，MAP组中的假单胞菌属数量相对较少，只占10.67%。环丝菌属占比则上升，达到38.04%。而不动杆菌属占比则减少，约为13.02%。N2组和VP组中的假单胞菌属占据优势地位，占相对丰度的41% 以上。N2组的不动杆菌和希瓦氏菌占比较低，分别为12.78%和4.83%。VP组中环丝菌属，不动杆菌属和希瓦氏菌属的相对丰度都比PP组低，比例分别为18.62%、14.26%和10%。
以上结果表明，在贮藏后期，PP组假单胞菌属是主要的腐败菌，这与Ercolini等研究结果一致。这是因为假单胞菌属为嗜冷需氧菌，代谢能力强，并且假单胞菌属还能分泌嗜铁素，抑制其它微生物的生长，因而逐渐生长为优势菌种。而MAP组中其相对丰度较低，这可能是高浓度的CO2抑制了需氧细菌的呼吸作用和酶活性，从而防止冷鲜鸡肉的腐败。
环丝菌属在贮藏初期相对丰度较低，随着贮藏时间的延长至第7 d时，环丝菌属逐渐变为优势菌属。其在PP组、MAP组、N2组和VP组有较高的相对丰度，占比最高可达38.04%。这是因为环丝菌属对环境适应能力强，在低温条件下仍可生长繁殖。此外，环丝菌属是一种兼性厌氧菌，在厌氧条件或有氧气条件下都能繁殖，并产生偶姻、乙酸、异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、乳酸、二氧化碳和乙醇等化学物质，导致肉变质，甚至变色和形成粘液。
不动杆菌属是导致肉制品腐败的主要微生物，是传播人类病原体的重要媒介。有研究表明鸡肉在冷藏贮藏期间不动杆菌属是较为常见的菌属。贮藏初期，不动杆菌属的占比为 11.20%。贮藏到第 7 d时， PP组，MAP组，N2组和VP组的不动杆菌属分别为24.22%、13.02%、12.78%和14.26%。结果表明，PP组中的不动杆菌占比大幅上升。这可能是不动杆菌属为专性需氧菌属，PP组中存在的大量氧气有利于其繁殖。与PP组相比，MAP组、N2组和VP组中不动杆菌的相对丰度下降，这可能是在无氧条件下不动杆菌属的生长受到抑制以及其他微生物生长对不动杆菌的抑制。
希瓦氏菌属是另一种腐败菌属，能通过群体感应信号分子调节生物膜的形成和腐败基因的表达。Mai等认为希瓦氏菌是冷鲜鸡中的优势腐败菌，并评估了其生长潜力。在贮藏初期，希瓦氏菌的相对丰度较低。贮藏到第7 d时，PP组，MAP组，N2组和VP组中希瓦氏菌的相对丰度上升，成为了优势腐败菌。这可能是希瓦氏菌属能耐受低温环境。另外希瓦氏菌也属于兼性厌氧菌属，能够使用电子受体（如三甲基胺-N-氧化物（TMAO））来代替氧气，在有氧或缺氧条件下都能存活。
注：选择本研究获得的属水平上相对丰度在前20位的细菌。
2.3.3 样品菌群变化的热图分析结果 图4对所有样品中的微生物多样性的相对丰度进行深入分析。不同的颜色的深浅代表图中每个物种的聚集度。如图4显示，新鲜鸡肉中微生物群落没有出现明显的聚集，表明新鲜鸡肉中微生物群的多样性在第0 d最高。初始样品的优势菌属为黄杆菌属、金黄杆菌属、嗜冷杆菌属。但在贮藏后期样品中它们的丰度都明显下降且大多数微生物群的相对丰度下降，优势菌属也发生了改变。在贮藏至第7 d时，托盘包装中假单胞菌属和环丝菌属占据优势，这表明低温环境不足以抑制假单胞菌属和环丝菌属的生长，这可能与托盘包装中含有大量氧气有关。气调包装中环丝菌属显示出高聚集度，假单胞菌属的聚集度则较低，这表明环丝菌属对CO2有较高的耐受性，充氮包装和真空包装组中假单胞菌属的聚集度较高，造成这一现象的原因这可能是包装设备不能把包装盒中的空气完全抽出，导致包装内存在少量空气。包装内残留的气体有助于好氧的假单胞菌属的生长，加速了冷鲜鸡的变质。另外，在PP、MAP、N2和VP组中假单胞菌属丰度较高，可能是假单胞菌属具有蛋白水解、脂肪分解、糖分解等的能力。因此，假单胞菌属可以利用冷鲜鸡肉中的营养物质进行生长繁殖，从而促进冷鲜鸡肉的腐败变质。
2.3.4 冷鲜鸡贮藏过程中菌群变化的主成分分析 通过主成分分析进一步揭示了4组细菌群落结构的显著差异（图5）。第一主成分对样品差异的贡献率为64.88%，第二主成分为10.23%。贮藏初期，CS组的3个样品在PCA图中的距离较远，表示样本组成差异很大。经过冷藏保存后，第0 d的微生物的组成与第7 d评估的样品明显分离，有显著差异。这表明冷藏鸡的微生物多样性随贮藏时间的增加而变化。充氮包装、气调包装和真空包装方式的冷鲜鸡微生物多样性都降低。采用气调包装的三个样品聚集性最高，表示菌群结构相似度高，差异性较小。PP组与MAP组、N2组和VP组的结果不同，3个样品的分布明显不同，表明冷鲜鸡肉的微生物群落组成差异性最大。综上所述，不同的包装处理和贮藏时间改变了冷鲜鸡中的微生物群落组成。
3 结论
本文对不同包装条件冷鲜鸡贮藏过程中腐败相关微生物菌群的变化进行了分析。研究表明，MAP组、N2组和VP组都能显著抑制腐败微生物的生长（P＜0.05）。
同时，高通量测序分析结果表明，所有样品在贮藏后期的微生物丰富度降低。不动杆菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属和嗜冷杆菌属是新鲜鸡胸肉中的优势菌属。随着贮藏时间的推移，构成鸡肉微生物群的各种物种之间存在潜在的竞争，部分菌属被取代。假单胞菌属、环丝菌属、不动杆菌属和希瓦氏菌属发展为优势菌属。然而，不同包装方式贮藏的冷鲜鸡样品中的腐败相关的微生物相对丰度存在差异。MAP组能有效控制假单胞菌属和不动杆菌属，而N2组能显著降低不动杆菌属和希瓦氏菌属的相对丰度。VP组能使不动杆菌属、环丝菌属的相对丰度下降。因此，不同的包装方式对减少相应优势腐败菌有积极作用。此外，应进一步开发其他抗菌方法，以结合气调，充氮或者真空包装，进一步延长冷鲜鸡的保质期，使这种保鲜方式在肉类工业中得到广泛应用。
