羊肉屠宰加工场主要污染菌的分布及其对熟制羊肉的致腐能力

　　摘要：对江苏省苏州市具有代表性的某羊屠宰场的屠宰环境及熟制品加工车间进行了微生物检测，重点对熟制品加工过程进行检测，包括煮制车间的接触面、各加工车间的的空气以及清洗前后的生肉与煮制后的熟肉，以确定熟制品加工过程中污染菌群的分布。结果表明，熟制品加工过程中各加工车间空气细菌数均低于10CFU/皿，表明空气质量合格。而煮制车间的接触面污染较严重致使交叉污染造成熟制羊肉的菌落总数达到3.23 Log CFU/cm2。结合形态观察和16S rDNA 菌种鉴定，所污染的菌主要为芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、变形杆菌、金黄杆菌和微杆菌等。随后选取三个污染菌芽孢杆菌和腐生葡萄球菌，通过对熟制羊肉的感官评价、pH 值、菌落总数、挥发性盐机氮值和腐败代谢产物产量因子的测定来评定它们对熟制羊肉的致腐能力。结果显示，Bacillus sp.M1 的致腐能力最强且明显高于S. saprophyticus M7 和Bacillus sp.M9，为有效预防和控制熟制羊肉的微生物污染提供依据。

　　关键词：羊肉屠宰场；腐败菌；芽孢杆菌；腐生葡萄球菌；致腐能力

　　近年来，羊肉深受消费者的喜爱，作为一种高需求的肉制品，肉的品质影响消费者的选择。羊肉在屠宰、加工、贮存和运输中,易因微生物的污染而腐败变质 ，因而屠宰加工环境的卫生情况将直接影响羊肉的品质，周玉春等和王兆丹等 研究发现有效控制屠宰加工的环境卫生，对保证肉品质量起着积极的作用。

　　市售羊肉中以冷鲜肉和熟制羊肉为主，国内外对冷鲜肉及包装肉制品中菌群鉴定及其相关腐败菌的致腐能力研究较多，例如Borch等研究了冷鲜肉和加工肉制品中的腐败细菌，包括假单胞菌属、不动杆菌属、热死环丝菌、肠杆菌科等，而熟制羊肉中腐败菌的研究相对较少。煮制处理虽然能够抑制微生物污染，起到防腐杀菌的作用，但是芽孢具有很强的抗高压、抗化学药物、抗辐射、抗热性，它们可在高温高压的环境中存活下来，当条件适合时，芽孢继续萌发为营养体，致使产品腐败变质，另外熟肉制品多通过简易的保鲜膜包装销售或在完全敞开的环境下销售，也易受环境中微生物的污染，造成产品的货架期很短，严重制约了熟肉品的生产和流通。因此，通过对特定腐败微生物致腐能力的测定，有利于人们采取更直接的策略和技术防止食品的腐败变质。

　　为了研究微生物对羊肉的致腐能力，本研究通过对某羊屠宰场的屠宰环境及熟制品加工车间进行微生物检测和鉴定，选取三株优势腐败菌Bacillus sp.M1、S. saprophyticus M7、Bacillus sp.M9，分别接种熟制羊肉，无菌包装，于7℃冷藏贮藏，比较各优势腐败菌对熟制羊肉的致腐能力，从而为有效的预防和控制熟制肉品的微生物污染提供数据支持。

　　样品来源 江苏省苏州市具有代表性的某羊屠宰场、熟制品加工车间。

　　培养基：营养肉汤培养基购自北京陆桥技术有限责任公司

　　试剂：细菌基因组提取试剂盒；通用引物8F: 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’; 1541R: 5’

　　AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；硼酸、氧化镁、氯化钠等试剂均为国产分析纯。

　　UniCen MR台式冷冻离心机；pHS-25B型数字酸度计；UV-6100型紫外可见分光光度计； LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台；T-25数显匀浆器；培清JS-600W电泳仪；TaKaRa TP600梯度PCR仪。

　　1.3.1 羊屠宰场和熟制品加工过程中的菌群分布

　　1.3.1.1 样品采集:通过前期对屠宰过程的调研，主要对屠宰环境水、加工车间空气、接触面和肉制品进行微生物检测，样品采集工艺流程图如图1。

　　屠宰环境水采样: 戴一次性无菌手套，取羊屠宰环境的水样，取三个重复样。

　　加工车间空气中微生物检测 ：对熟制品加工车间包括（冷却间、煮制间、冷藏间、包装间）进行空气检测。将冷却凝固的计数琼脂平板开盖置于不同房间四个角落和中心位置5 min，然后于37℃培养。

　　接触面：熟制品加工车间（台面和托盘）的取样：采用棉拭子涂抹法，参考雷质文方法并做调整，将5cm×5cm标准灭菌规格板，放在被检托盘或台面表面，用浸有生理盐水的3个棉拭子在规格板内均匀涂抹整个方格，剪去手接触部位后，将棉拭子放入盛有100 mL生理盐水的三角瓶中，移动规格板，涂抹四次，使采样面积达到100 cm2，将所有棉拭子放入三角瓶中，重复上述操作，取三个重复样，将样品封口保存。

　　肉样品取样：对熟制品加工车间屠宰后（煮制前清洗前、煮制前清洗后、煮制后）的羊肉进行取样。将5g肉样无菌剪碎后置于45 mL已灭菌的生理盐水中37℃摇床培养30min，取三个重复样。

　　1.3.1.2 样品中菌落总数的测定 菌落总数的检测参照 GB/T4789.2-2010 ，《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。

　　1.3.2 菌株的形态学观察和鉴定

　　形态学观察：挑出以上培养的熟制品加工车间空气环境、接触面、肉样的单菌落进行结晶紫染色后在普通显微镜下进行形态学观察。

　　16S rDNA 鉴定：挑出以上培养的熟制品加工车间环境、接触面、肉样的单菌落于营养肉汤培养液中培养，利用基因组提取试剂盒提取目标菌株染色体DNA，并以此为模板，利用细菌16S rDNA通用引物8F: 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’; 1541R: 5’ AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 扩增目标菌株的16S rDNA 序列 。PCR 扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min 30 s，30 个循环；最后72℃延伸10 min。PCR 产物经凝胶回收纯化后, 送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果序列同源性分析利用BLAST 软件在线比对。用MEGA6.0 软件以Neighbor Joining 法构建系统发育树。

　　1.3.3 主要污染菌对熟制羊肉致腐能力的测定

　　1.3.3.1 主要污染菌的接种与熟制羊肉的贮藏

　　从市场上购买新鲜的羊肉，高温蒸煮后，于无菌环境分割成碎块，每20g一份分装至无菌包装袋中。取从熟制品加工车间分离的3株优势菌株进行平板划线，在适宜温度条件下培养24 h。挑取单菌落，过夜培养，按1%的接种量接种于300 mL的营养肉汤培养基中培养，至菌液浓度达到7 LogCFU/mL 时，经适当稀释后按2-3 Log CFU/g 肉接种至分装好的羊肉中，热封封口，于7℃贮藏，每隔2 天取样进行后续调查。

　　1.3.3.2 熟制羊肉于7℃贮藏过程中感官评定

　　由十名感官评定人员采用10分制进行评分，羊肉感官指标包含色泽、质地和气味，10分为最好品质，2分为有表面暗深且有浓的腐臭味即腐败点，评价标准如表1所示。

　　1.3.3.3 熟制羊肉于7℃贮藏过程中pH 值的变化

　　取样品2g于离心管中加入18mL 蒸馏水匀浆（6000 rpm/min）1 min，使用pH 计测定pH 值。

　　1.3.3.4 熟制羊肉7℃贮藏过程中菌落总数的变化

　　取样品10g加入到90mL的生理盐水中，10倍梯度稀释，利用平板计数对接种不同污染菌的肉进行菌落计数。

　　1.3.3.5 熟制羊肉7℃贮藏过程中挥发性盐机氮（TVB-N）的变化

　　采用GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法测定

　　1.3.3.6 腐败能力的定量分析

　　将TVB-N 产量因子Y(TVB-N/CFU)作为各污染菌腐败能力的定量指标，以接种到无菌肉块上的各腐败菌的TVB-N 产量来表示。腐败代谢产物产量因子YTVB-N/CFU 的计算公式为：

 

 

　　文中Ns、N0分别为为腐败点、起始点的菌落总数（CFU/g）,(TVB-N)0、（TVB-N)s为起始点与腐败点TVB-N 的含量（mg N/g）

　　1.3.4 数据处理与统计分析

　　采用Excel 进行数据处理，三次重复，取均值和标准差。origin8.0（Origin Lab 公司）图形分析处理软件进行图形处理，并用统计学软件SPSS 17.0（IBM 公司）对数据进行单因素方差分析,进行显著性比较(P＜0.05)。

　　对羊屠宰场的屠宰环境及熟制品加工车间进行微生物检测，结果见图2。结果表明：屠宰水样的菌落总数为4.80 LogCFU/mL，说明屠宰水样污染较严重。熟制品加工车间空气中细菌数见表2，各加工车间细菌数均低于10个/皿，表明空气质量基本合格。但清洗车间、包装车间和冷藏车间的细菌总数高于煮制车间和冷却车间。所以清洗车间、包装车间和冷藏车间的环境卫生尚需进一步提高。

　　由以上结果可知生鲜制品在煮制前需经过清洗，以尽可能减少微生物的数量，不仅可以改善煮制过程中的杀菌效果，亦可减少煮制后生、熟制品交叉污染对熟制品造成的二次污染。本文对清洗前后的肉样进行调查，发现清洗前肉的菌落总数为5.22 Log CFU/g，清洗后肉的菌落总数为5.39 LogCFU/g，即清洗对生鲜肉微生物的污染未起到较好的减菌作用，这可能是与清洗肉的水反复利用，未及时更换，水样已遭到严重污染有关，应改为流动水或提高更换清洗水的频率。

　　在良好的卫生程序中，对生产过程中与食品接触的接触物表面菌落总数规定的建议性标准为在1.70 Log CFU/cm2以下为极满意水平，1.70-5.00 Log CFU/cm2为可接受水平，达到5.00 LogCFU/cm2为不可接受水平。本文对熟制品加工过程中接触面的微生物污染进行检测，结果见图1，接触台面菌落数为3.64 LogCFU/cm2、接触托盘为1.77 LogCFU/cm2，二者均在1.70-5.00 LogCFU/cm2之间为可接受水平。但接触台面菌落数高于接触托盘，且已接近不可接受水平的上限，说明接触台面污染较严重。调查后发现，熟肉的菌落总数为3.23 LogCFU/g，这极有可能与污染较严重的接触台面接触造成的二次污染有关。所以控制熟制品加工过程中清洗车间、包装车间及冷藏车间的环境卫生、接触面（台面、托盘）的微生物污染是防止熟制品微生物污染的主要途径。

　　图2 羊屠宰场的屠宰水样、熟制品加工过程中接触面、肉样的菌落总数

　　注：同一组别的不同字母表示差异显著（P<0.05）

　　表2 熟肉加工车间空气中的细菌数检测

　　2.2 熟制品加工过程中污染菌群形态学观察与鉴定

　　2.2.1 熟制品加工过程中污染菌群形态学观察

　　根据屠宰场的菌群分布状况，选取了9 株（M1-M9）生长代谢较旺盛、菌落形态有差异的菌株进行形态学观察（图3）和16S rDNA 鉴定。结果表明菌株形态各异，杆状居多， 初步断定多数为杆菌，为进一步确定污染菌株，提取分离的9 株菌的基因组 DNA 后，通过 PCR 扩增获得16S rDNA 序列，琼脂糖电泳检测结果见图4，发现目的片断长度约为 1700 bp，随后将16S rDNA 片段送生工生物进行测序。

　　图3 熟制品加工过程中污染菌结晶紫染色后的显微镜图片（×1000）

　　将16S rDNA 测序结果进行Blast 比对，初步鉴定，M1、M3 为Bacillus，M2 为β-变形菌（Betaproteobacterium），M4 为金黄杆菌（Chryseobacterium profundimaris）, M6 为嗜糖小细菌（Microbacteriumsaccharophilum）, M7 为（Staphylococcus saprophyticus）, M9 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。M5、M8 与嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。16S rDNA 最高序列一致性仅为75%，因此二者可能与已报道的菌种差异较大，有可能是新型菌种。

　　经系统进化分析（图5），M1、M3、M9 与B. aryabhattai，M7 与S. saprophyticus，M2、M4、M6与各相应已鉴定的菌种位于同一分支。M5 与M8 位于单独的分支，这与Blast 比对结果是一致的。

　　熟制品加工过程中芽孢杆菌为主要的污染菌株，并且在熟肉和接触托盘中均被鉴定出。原因是该菌能形成芽孢，耐高温、耐低温、耐强酸、耐强碱、对外界有害因子抵抗力强。而煮制肉的温度达不到杀死芽孢的温度，一旦条件允许，芽孢萌发，致使熟制羊肉中仍存在芽孢杆菌。S. saprophyticus 在熟肉制品与煮制间、包装间被检出。S. saprophyticus 是常见的腐败菌，其存在于熟制品加工环境中可能是由于生产环境卫生不达标所致。在熟肉制品及接触台面、冷藏库、包装间中仍有Betaproteobacterium、C. profundimaris 和M. saccharophilum 非优势腐败菌的检出，原因也应与加工过程环境卫生未达到标准有关。

　　根据熟肉加工过程中各菌落分布与生长状况，选取三株主要污染菌Bacillus sp.M1 、S.

　　saprophyticus M7、Bacillus sp.M9 接种熟制羊肉，于7℃贮藏，进行致腐能力测定。

　　2.3.1 熟制羊肉贮藏过程中感官评定

　　对贮藏期内接种不同污染菌的熟制羊肉进行感官评价，结果如图6。随着熟制羊肉贮藏时间的增加，接种三株污染菌的熟制羊肉其腐败程度均加剧，感官可接受性逐步降低，在12天时均达到腐败点，0-12天为不可接受范围之内。在贮藏过程中，接种Bacillus sp.M1的熟制羊肉感官评分略低于接种其它两株菌的感官评分，但未呈现显著差异（P＞0.05）。

　　注：同一时间不同污染菌的不同字母表示差异显著（P<0.05）

　　2.3.2 熟制羊肉贮藏过程中pH 值的变化

　　对贮藏期内接种不同污染菌的熟制羊肉进行pH 值测定。结果如图7，贮藏前期（0-6天），pH逐渐下降，这可能与污染菌产生一些酸类物质有关，而贮藏中后期（6-15天），pH 值呈现上升趋势，这可能与随着贮藏天数增加熟制肉中产生一些胺类物质 ，对pH 值的影响高于酸类物质有关。但接种三种腐败菌后熟制羊肉pH在9天时呈现显著性差异(P＜0.05)，但随着贮藏时间的增加未呈现显著性差异(P＞0.05)。

　　注：同一时间不同污染菌的不同字母表示差异显著（P<0.05）

　　2.3.3 熟制羊肉贮藏过程中菌落总数的变化

　　肉中细菌的数量是表示其腐败程度的重要指标，熟制羊肉在贮藏过程中各污染菌菌落数的变化如图8 所示。随着贮藏天数的增加各腐败菌菌落总数逐渐增加，且在第3天到第6天增加迅速，在第6天时，接种Bacillus sp.M1 和S. saprophyticus sp. M7 的熟制羊肉的菌落总数达到6.72Log CFU/g 和6.71Log CFU/g，这与黎园园等研究第5 天时解冻猪肉已产生强烈的腐臭味，热死环丝菌菌数达到6.62lg(CFU/g)相似。后随着贮藏时间的延长，菌落数持续缓慢增加。接种Bacillus sp.M1 和S.saprophyticus sp. M7 的熟制羊肉菌落数无明显差异（P>0.05），但二者明显高于接种Bacillus sp.M9的熟制羊肉菌落总数（P＜0.05）。

 

　　注：同一时间不同污染菌的不同字母表示差异显著（P<0.05）

　　2.3.4 熟制羊肉贮藏过程中TVB-N 的变化

　　挥发性盐基氮(TVB-N)是指肉及肉制品水浸液在碱性条件下能与水蒸汽一起蒸馏出来的总氮量，是评价肉制品新鲜度的一项重要指标，挥发性盐基氮是由于微生物感染并繁殖，进入肌肉组织内部，并分泌一系列酶从而引起脱氨、脱羧作用，导致蛋白质分解而形成的产物。如图7 所示，在贮藏过程中，各接种菌组TVB-N 的含量随贮藏时间的延长而增加。在GB2707-2005 鲜（冻）畜肉卫生标准中规定挥发性盐基氮的指标为≤15mg/100g，熟制羊肉在贮藏6-9天时TVB-N 含量增加迅速，并且在贮藏第6天时TVB-N 值已超过15mg/100g。所以贮藏第6天时污染菌致腐性已明显显现。本试验中，接种Bacillus sp.M1 和S.saprophyticus M7 的熟制羊肉TVB-N 的含量要显著（P＜0.05）高于接种Bacillus sp.M9 的肉品TVB-N含量。

 

　　2.3.5 腐败能力的定量分析

　　污染菌的致腐败能力用腐败代谢产物产量因子（YTVB-N）来表示，即货架期终点时单位数量污染菌产生腐败代谢产物量的多少。由于不同腐败菌利用分解肉品中蛋白质产生的代谢物不同，引起肉品腐败的程度和特性的不同。YTVB-N可定量地表示每种优势腐败菌在相同时间内产生TVB-N的量，由此可反映不同优势腐败菌导致羊肉腐败能力的差异。由表3可看出，Bacillus sp.M1的YTVB-N为1.39×10-6mg/CFU，略高于S. saprophyticus M7的1.32×10-6mg/CFU，且二者显著高于Bacillus sp.M9的1.90×10-7mg/CFU。因此，Bacillus sp.M1和 S. saprophyticus M7的致腐能力显著高于Bacillus sp.M9，且Bacillus sp.M1的致腐能力略高于S. saprophyticus M7。这正与前文中感官评价评分（图6）、菌落总数（图8）、TVB-N（图9）值含量的变化基本相符。

　　本试验通过对江苏省苏州市具有代表性的某羊屠宰场的屠宰环境及熟制品加工车间进行微生物检测，重点对熟制品加工过程中包括接触面（接触托盘、接触台面）和清洗前后的生肉与煮制后的肉进行微生物检测，确定熟制品加工过程中污染菌群的分布。煮制之前的清洗未能起到很好的减菌作用，且熟制品加工过程中接触面污染也较严重致使交叉污染使熟制羊肉的菌落总数达到3.23 LogCFU/cm2。所以改良清洗流程及控制熟制品加工过程中接触面卫生是控制肉制品被微生物污染的重要步骤。

　　对熟制品加工过程中污染的菌株进行16S rDNA 鉴定，并构建系统发育树。所污染的腐败菌主要为芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、变形杆菌、金黄杆菌和微杆菌等，根据各菌落分布与生长状况，选取三株主要污染菌Bacillus sp.M1、S. saprophyticus M7、Bacillus sp.M9 接种熟制羊肉，通过对熟制羊肉的感官评定、pH、菌落总数、TVB-N 值和腐败代谢产物产量因子的测定来鉴定它们对熟制羊肉的致腐能力。最终得出Bacillus sp.M1 和S. saprophyticus M7 的致腐能力显著高于Bacillus sp.M9，且菌株Bacillus sp.M1 的致腐能力略高于S. saprophyticus M7。为后续对熟制羊肉中主要的污染菌群进行针对性的靶向抑制，以延长熟制羊肉的货架期提供参考。