花青素纳米纤维智能标签对羊肉新鲜度的无损检测

　　摘要：为实现羊肉新鲜度的无损、实时、可视化检测，及建立可靠的预测模型，将花青素纳米纤维智能标签应用于市售温度（10±2）℃储藏下的羊肉，并测定了智能标签的微观结构和胺敏感性，以及羊肉储藏过程中的新鲜度指标（感官品质、挥发性盐基总氮含量（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）、pH值、菌落总数、酸度/氧化力系数）和纤维膜的色差。结果表明：花青素纳米纤维膜呈淡粉色，由250nm左右的均匀纤维丝组成，具有胺敏感性；羊肉的各新鲜度指标指示其在储藏72h时已腐败变质，同时纤维膜由粉色变为白色；相关性分析表明纤维膜色差与各新鲜度指标具有显著相关性（P＜0.05），并建立了准确率为 88.2%的色差对TVB-N的预测模型（R2=0.967）。综上所述，羊肉新鲜度的无损、可视化和实时检测可通过花青素纳米纤维智能标签实现，且根据标签颜色即可初步预测羊肉新鲜度级别，为解决肉类安全问题提供了新思路。

　　关键词：无损检测；预测模型；羊肉新鲜度；智能标签；纳米纤维膜

　　引言

　　近年来，随着人们生活水平的提高，食品安全问题受到了广泛重视。肉类可以为机体提供微量元素，是重要的矿物质来源，已成为日常饮食中不可或缺的部分，所以对其安全性的控制与检测尤为重要。究其根本，要解决肉类安全性问题，首先要实现其新鲜度的实时检测，这样才能有效控制产品流通与销售，进而达到提高肉类安全性指数的目的。肉类新鲜度级别由挥发性盐基总氮含量（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）划分，但传统检测方法过于复杂，且耗时较长，不能实现实时检测。因此，为实现肉类新鲜度的无损及可视化检测，让普通大众也可获悉产品品质优异的目的，研究者们开始着眼于开发可对肉类特征性腐败物质具有响应性的智能标签。

　　目前，检测肉类新鲜度的智能标签大多是基于指示材料对包装环境的pH值敏感性而制备的，其可以在不同pH值条件下显示出不同颜色，进而实现新鲜度的分级与检测。随着人们对肉类安全的重视，基于合成型pH敏感材料（二甲酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲酚红、 甲基红和溴百里酚蓝）和天然型敏感材料（花青素和茜素）的智能指示标签均已被制备。在这些研究中，虽然可以对肉类新鲜度进行无损、实时及可视化检测，但大多只采用TVB-N和菌落总数进行新鲜度划分，指标过于单一，准确性不高。并且这些新鲜度指标在与标签颜色变化进行相关性分析时，也只是粗略的用肉类腐败阈值和标签颜色进行比对，不能实现对肉类剩余货架期的预测。由此可见，肉类新鲜度的检测及其剩余货架期的预测尚不全面，准确性有待进一步验证，不利于解决肉类安全问题。综上所述，为实现肉类新鲜度较为准确的无损、实时及可视化检测，以及剩余货架期的预测，明确智能标签颜色变化与新鲜度指标的关系，参考Sun等制备的纳米纤维膜方法，制备花青素纳米纤维智能便签应用于羊肉新鲜度检测中，结合方差分析和相关性分析，建立智能标签对羊肉新鲜度的预测模型，为肉类新鲜度的无损、实时及可视化检测开辟新思路。

　　1  材料与方法

　　材料：纳米纤维膜由Sun等提供；羊肉来自内蒙古乌拉特中旗苏尼特羊育种园区，选取12月龄苏尼特羊，于6:00吊挂屠宰，去除头、蹄和内脏后，迅速在胴体上取后腿肉100g，迅速放入冰盒中，待用。

　　试剂：氨水、氧化镁、硼酸、浓盐酸，均为分析纯；PCA（plate count agar）培养基；甲基红、溴甲基酚绿，麦克林试剂。

　　1.2  仪器与设备

　　pH-STAR型胴体pH计；CR-20型色差计；Pro-Nitro A全自动凯氏定氮仪；SEM4000扫描电镜；UV-2450紫外分光光度计。

　　1.3  试验方法

　　1.3.1  纳米纤维膜的制备

　　纳米纤维膜的制备参考Sun等的方法，称取质量分数为12%的聚乳酸（Polylactic Acid，PLA）置于二氯甲烷（Dichloromethane，DCM）溶液中，并在磁力搅拌器上以500r/min持续搅拌直至 PLA颗粒全部溶解；称取质量分数为0.4%的花青素溶于二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）中，并在磁力搅拌器上以500r/min持续搅拌直至花青素全部溶解，随后将该溶液倒入PLA溶液中，充分混合制成纺丝溶液，其中DCM/DMF的质量比为3∶2。

　　静电纺丝步骤参考Sun等的方法，将纺丝溶液注入到可以垂直沉降的注射器（体积为10mL）中，将其放于静电纺丝机中，选用五喷头器件进行纺丝。纺丝参数为：正电压为+20kV；相对空气湿度为20%；溶液的进料速度为1mL/h；转筒速度为150r/min；纤维丝的空间积累距离为18cm；空间积累时间为30min。最后将所得的纳米纤维膜放于50℃的真空干燥箱中干燥至恒质量。

　　1.3.2  纳米纤维膜的表征

　　1）扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）通过扫描电子显微镜（SEM-TM4000Plus，Hitachi High-Technologies Corporation，Japan）研究花青素纳米纤维膜的表面形貌特征。每幅图像的最大施加电压为15kV，工作距离为1～5mm。选用image pro 6plus作为SEM图像的分析软件。

　　2）胺敏感性选用氨蒸汽作为模型气体，采用顶空方法检测膜的胺敏感性。依据亨利定律，氨蒸汽浓度通过容器中氨溶液的气液平衡来控制。传感试验在25℃下、相对湿度54%条件下进行，先向培养皿中注入15mL浓度为1～100mg/L的氨水，然后将膜（1cm×2.5cm）密封于其中，充分反应 24h后，通过UV-2450紫外分光光度计测定膜的光学吸收变化。

　　1.3.3  纳米纤维膜对羊肉新鲜度的检测

　　选取羊后腿肉，放入超净台中紫外灭菌20min，切除表面肉层，并将羊肉均分为25g放于包装盒中，将纳米纤维膜（1cm×2cm）放于顶部，不接触肉样。试验温度选用大型超市的市售温度（10±2）℃，纤维膜照片拍摄在灯的位置、入射角和强度恒定的灯箱中进行。每天测定感官品质、TVB-N、菌落总数、pH值、酸度/氧化力系数和纳米纤维膜的色差值E，直至羊肉彻底腐败变质。每次试验设置3个平行，重复进行3次，以验证结果准确性。

　　感官评定：选10名经过培训的评价员对储藏期间的羊肉进行感官评分，评分标准见表1。

　　TVB-N：参考GB 5009.228-2016的方法，利用全自动凯氏定氮法测定TVB-N含量，每个样品测定3次取平均值。

　　菌落总数：参考GB 4789.2-2016的方法，选用平板计数法测定肉样的菌落总数，每个样品测定3次取平均值。

　　pH：使用胴体pH计测定羊肉pH值，每个样品测定3次取平均值。

　　酸度/氧化力系数：参考朱民望的方法，取10g肉样，去除筋膜，切成肉糜，加入90mL蒸馏水，搅拌均匀后静置30min，过滤待用。取10mL滤液，加入40mL蒸馏水，混匀后滴加五滴酚酞试剂，用0.1mol/L NaOH溶液滴定，当样液变为淡红色且半分钟内不褪色时，消耗的NaOH溶液体积即为酸度值。量取50mL蒸馏水置于三角烧瓶中，依次加入5mL 0.2mol/L 硫酸和1滴0.02mol/L高锰酸钾溶液，混合加热至40～50℃，再加入10mL肉样滤液，立即用0.02mol/L高锰酸钾滴定，直至溶液呈玫瑰红色且30s内不褪色即为滴定终点，所消耗的高锰酸钾溶液的体积即为氧化力值。

　　纳米纤维膜的色差：使用色差仪测定纤维膜的颜色，L*为亮度值，a*为红度值，b*为黄度值，每个样品测定3次取平均值。色差?E计算公式如下

　　                 （1）

　　式中L*0，a*0和 b*0为纤维膜的初始颜色值，L*，a*和b*为纤维膜使用之后的值。

　　1.4  数据统计与分析方法

　　使用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析，使用Origin2018软件进行作图分析，选用Image plus pro6软件测量纤维的直径，采用JMP Pro 14软件进行相关性分析、预测模型的建立和模型准确度的计算。模型准确度是预测为正实际为正和预测为负实际负占总样本的比例。

　　2  结果与分析

　　由图1可知，纳米纤维智能标签宏观上呈淡粉色，且柔软轻薄。由SEM的图像证明，智能标签微观上由直径约为250nm的平滑、均匀和连续的纳米纤维丝构成，无明显串珠现象。

　　肉在腐败过程中产生的挥发性气体中，NH3、二甲胺和三甲胺是几种主要的碱性特征性挥发性成分。其中NH3是结构最为简单，且对环境pH值具有直接影响的气体，所以选用该气体作为检测纳米纤维智能标签敏感性的模型气体。为测定纳米纤维膜的胺敏感性，将膜暴露于氨溶液中（1～100mg/L）过夜后，使用UV-2450紫外分光光度计确定粉色纳米纤维复合膜的光学吸收变化，结果如图2所示。花青素的紫外吸收峰在500～550nm之间，UV-2450紫外分光光度计检测到纳米纤维膜在533nm处出现最大吸收峰。随着氨浓度的增加，膜的吸收峰逐渐下降，当浓度大于70mg/L时，最大吸收峰基本消失。此反应的感应机制为：纳米纤维膜初始呈鲜艳的粉红色；当暴露于氨蒸汽后，花青素中发生亲核加成反应，电子发生转移，碳原子上的电子转移到氧原子上，形成了碳正离子；碳正离子吸引游离的氢氧根，双键断裂成单键，最终形成半缩酮；半缩酮是一种无色物质，其在一定温度下吡喃环可以被打开，进而形成顺式查尔酮结构，这种结构也是一种无色物质。综上所述，纳米纤维膜在533nm的紫外吸光度与氨浓度呈反比关系（关系式为：y=0.90706-0.0038x，R2=0.9897），证实了纤维膜从粉色变为白色，可以被肉眼识别，为后期膜在羊肉的新鲜度检测应用中提供依据。

图1  纳米纤维膜的宏观形态与微观结构

　　2.3  纳米纤维智能标签对羊肉新鲜度的监测

　　2.3.1  羊肉储藏过程中新鲜度的分级

　　感官评定、pH值、TVB-N、菌落总数和酸度/氧化力系数是判定肉新鲜度的主要指标，通过测定羊肉储藏过程中上述指标的变化，实现对羊肉新鲜度的准确分级，并将分级结果与纳米纤维智能标签的色彩变化对比，分析智能标签对羊肉新鲜度检测的准确性。

　　感官评定是通过气味、色泽和组织状态实现对肉新鲜度明确的分级，是最为直观的判定方法。由表2可知，屠宰后的新鲜羊肉具有较好的风味和色泽、肌纤维致密有序、组织状态较好，感官评分较高，具有较高的食用价值。随着储藏时间的增加，羊肉感官评分逐渐下降，在48h时，羊肉的各项感官评分降至2.20～2.70之间，具体表现为轻微腐败味的出现、色泽变为暗红色、轻微的汁液流失、组织状态松散，食用品质明显下降。当羊肉储藏72h时，出现了明显的腐败味，色泽变为深红色，有较多汁液流失，肉的表面出现粘手现象，肌肉弹性彻底消失，食用品质降至最低。

　　注：表中不同小写字母表示同一指标不同储藏时间差异显著（P＜0.05）。

　　肉的pH值不仅对嫩度、保水性等品质有较大影响，还在一定程度上影响着肌肉内源酶活性，从而影响蛋白的降解，最终对肉的腐败进程产生影响，是指示肉品新鲜度的重要指标。如图3a所示，样品的初始pH值为5.68，分析原因是羊肉此时已进入糖酵解阶段，产生了较多乳酸，进而导致pH值偏低。随后，羊肉的pH值逐渐上升，这可能是由于肌肉氧气供应不足，肌质网被破坏，大量流失的Ca2+激活了钙蛋白酶体系，促进了肌原纤维蛋白降解为小分子多肽，部分多肽继续降解为游离氨基酸，这些游离氨基酸和肽类物质又被微生物利用进而生成胺类物质，最终使pH值升高。

　　挥发性盐基氮（TVB-N）包括氨及胺类物质，是肉在储藏过程中，蛋白质、多肽和氨基酸等含氮化合物被内源酶及细菌分解，产生的挥发性碱性物质，如氨、三甲胺、二甲胺、尸胺和腐胺等物质的统称。肉类的TVB-N值小于15mg/100g为新鲜肉，15～20mg/100g为次鲜肉，大于20mg/100g为腐败肉。由3b可知，羊肉初始TVB-N值为7.6mg/100g，储藏24h后为11.6mg/100g，此时羊肉处于新鲜级别；储藏48h时，TVB-N值升至18.8mg/100g，此时羊肉已降至次新鲜级；当储藏72h时羊肉的TVB-N值已增至32.9mg/100g，远高于腐败阈值，已经腐败变质。

　　微生物是导致肉腐败的主要原因，冷鲜肉新鲜度的评定标准为：一级鲜度：小于等于5lgCFU/g，次级鲜度：5～7lgCFU/g，腐败：大于等于7lgCFU/g。由图3可知，羊肉储藏前的菌落总数为2.1lgCFU/g，此时羊肉处于新鲜阶段。随着储藏时间的增加，菌落总数在24h时大幅度增加，羊肉达到次新鲜程度。随着微生物的迅速生长繁殖，在储藏48h时菌落总数增至 7.6lg CFU/g，高于腐败临界值，羊肉失去食用价值。

　　酸度/氧化力系数是肉pH值与氧化力的比值，是羊肉新鲜度的另一指示指标。由图3d可知，羊肉在储藏过程中酸度/氧化力系数值呈现下降趋势（P＜0.05）。原因是羊肉在储藏期间蛋白质在微生物的作用下被分解产生胺类物质，导致肉的酸度下降，致使酸度/氧化力值整体呈下降趋势，这与pH值结果规律一致。另一主要原因是随着羊肉微生物的大量繁殖和生长，导致氧化力增加，致使酸度/氧化力系数显著降低（P＜0.05）。

　　综上所述，羊肉在储藏过程中，pH 值逐渐升高，酸度/氧化力系数逐渐下降，菌落总数在储藏48h时达到腐败阈值；感官评定与 TVB-N则在羊肉储藏72h时，指示肉已腐败变质。综合以上指标，对羊肉进行新鲜度分级，即储藏时间t＜24h（新鲜），24h＜t＜48h（次新鲜），t＞72h（腐败）。

　　注：不同小写字母表示组间差异显著（P＜0.05）

图3：羊肉储藏过程中的新鲜度指标变化

　　2.3.2  纳米纤维膜的色差

　　为探究纳米纤维智能标签对羊肉新鲜度的监测可行性，以TVB-N作为划分羊肉新鲜度的主要指标，分析标签颜色变化与TVB-N的关系，结果如图4所示。羊肉在储藏过程中，随着腐败程度的增加，在内源性酶和微生物作用下，生成了挥发性生物胺，如氨、三甲胺、尸胺、腐胺等，这些碱性物质挥发后导致环境pH值增加，花青素中的黄酮离子发生水合作用形成了无色的查尔酮结构，致使纳米纤维膜产生颜色变化。新鲜羊肉的TVB-N值约为7.2 mg/100 g，储存1d后TVB-N微增至11.6mg/100g，同时纳米纤维膜颜色从红粉色变为浅粉色，?E（色差值）为4.9，已能被肉眼所识别。当羊肉储存3d时，TVB-N值增至32.97mg/100g，表明肉已变质腐败，同时包装盒中的纳米纤维膜从淡粉色变为白色，?E增至13.6，这可以让一个非专业人士裸眼识别。但根据数据结果显示，到羊肉储藏3d时，?E误差较大，同时观察到标签颜色在组间差异比较大，个别样品依旧呈淡粉色，未变成白色。分析原因是，羊肉的初始微生物污染菌株存在差异，导致其产生的挥发性生物胺不同，进而与花青素的反应不同，最终导致标签最后呈现的颜色不同。总而言之，纳米纤维智能标签颜色变化与肉的新鲜度指示指标TVB-N大致呈现一致的规律，可以依据标签颜色对羊肉新鲜度进行初步无损检测。

图4  羊肉储藏过程中智能标签的色差变化

　　2.4  智能标签监测羊肉新鲜度的预测模型及市场应用

　　2.4.1  新鲜度指标与标签色差的相关性分析

　　为分析新鲜度指标与纤维膜?E的关系，进行了相关性分析。由表3可知，纳米纤维膜 ?E与感官评分呈极显著负相（P＜0.001）、与酸度/氧化力系数呈显著负相关（P＜0.05）；?E与TVB-N、菌落总数和pH值均呈极显著正相关（P＜0.001）。由此可知，?E 与各指标呈较高的相关性，可以作为肉类新鲜度的评定指标。

　　注：*表示相关性显著（P＜0.05），**表示相关性极显著（P＜0.01），***表示相关性极其显著（P＜0.001）。

　　2.4.2  预测方程的建立

　　将感官评分、TVB-N、菌落总数、pH值和酸度/氧化力系数作为因变量，将?E作为自变量进行模拟。使用JMP软件中的标准二乘法，?E的宏选项选用响应面进项。利用JMP软件进行方程模拟，由表4可以看出，经过模拟，每个指标均被成功模拟出方程，且调整后的决定系数R2均在0.9以上，且极为显著，这表明模型已成功建立。由于TVB-N值有国标划分新鲜度的标准，所以选用TVB-N模型作为羊肉新鲜度的预测模型。预测模型如下

　　y1（感官评定值)=4.79-0.29?E+（?E-6.38）（0.007（?E-6.38））  （2）

　　Y2(TVB-N)=2.87+1.97?E+(?E-6.38)(0.097(?E-6.38))   (3)

　　Y3(菌落总数)=3.62+0.47?E+（?E-6.38)(0.039(?E-6.38))  （4）

　　Y4(pH值)=5.75+0.04?E+(?E-6.38)(-0.002(?E-6.38））   （5）

　　Y5(酸度/氧化力系数)=3.23-0.46?E+(?E-6.38)(0.069（?E-6.38))  （6）

　　2.4.3  市场应用及模型验证

　　将纳米纤维膜制成符合市场要求的智能标签，根据上述TVB-N模型方程对标签指示肉品新鲜度的剩余货架期进行预测，并应用于市场中做进一步验证。试验样本选取市售的内蒙古苏尼特羊后腿肉，包装方式为托盘包装，储藏温度与建立模型的温度一致（（10±2）℃）。由图5可知，纳米纤维智能标签可对羊肉新鲜度进行初步可视化监测，消费者能通过标签明显的颜色变化裸眼识别肉品新鲜度。智能标签的价格估算如表5所示，一个标签总价格约为0.0027元。为验证标签检测的准确性，JMP软件自动比对了羊肉真实TVB-N值与预测TVB-N值，结果如图6所示，发现二者呈正相关，且误差较小，预测准确度达88.2%。综上所述，智能标签价格低廉、方便快捷、操作简便，在肉类的无损、实时及可视化检测领域具有很大的应用前景，可实现肉类在生产、流通和销售过程中的新鲜度检测。

图5  羊肉销售过程中标签的应用

　　1）花青素纳米纤维智能标签由直径约为250nm的纤维丝构成，表面呈淡粉色，具有较好的胺响应性，智能标签在533nm的紫外吸光度与氨浓度呈反比关系R2=0.989 7。

　　2）智能标签可初步应用于羊肉新鲜度的实时及可视化检测中，其颜色变化与TVB-N大致呈现一致的规律。

　　3）标签颜色变化与各新鲜度指标有明确的线性关系，R2均大于0.9，根据色差值?E可预测羊肉新鲜度以及剩余货架期，准确率可达到88.2%，同时该标签价格低廉，只需0.002 7元，为今后实现肉类新鲜度实时、无损和可视化检测提供了新的方向与选择。