低温等离子体技术在肉品保藏及加工中的应用研究进展

　　摘 要：低温等离子体作为一种新兴的非热能技术已成为研究热点，该技术具有安全、温和、操作简便以及成本较低等优点，在食品非热加工领域具有广泛的应用前景。低温等离子体在激发过程中能够产生臭氧、单线态氧、超氧阴离子自由基、羟自由基、氮氧化物等活性物质，对肉品中微生物的抑制和亚硝酸盐的产生具有独特的作用。本文概述了低温等离子体的产生方式，分析了其工作效率和影响因素，并在此基础上从抑制微生物生长和替代亚硝酸钠两方面，介绍了低温等离子体技术在肉品保藏及加工中的应用研究进展，同时探讨了低温等离子体对肉品脂肪氧化的影响，并对其应用前景进行展望，为推动低温等离子体技术在肉品研究中的应用和推广提供理论参考。

　　关键词：低温等离子体；肉品；活性物质；微生物生长；亚硝酸盐

　　低温等离子体技术作为一种新兴的非热能食品加工技术，引起了全球众多研究者的关注。与食品热加工技术相比，该技术具有安全、温和、操作简便和成本较低等优点。随着低温等离子体技术的发展，其已被广泛应用于材料加工、电子学、聚合物加工、生物医疗器械和生物材料等领域。基于低温等离子体技术的诸多特点，其在食品领域也得到了应用。目前关于该技术在肉制品中的应用研究也引起了广泛关注，主要包括两个方面：一是低温等离子体处理减少肉和肉制品中致病性微生物方面的研究；二是低温等离子体技术处理可以生成亚硝酸盐，替代肉制品腌制过程中亚硝酸钠（NaNO2）添加方面的研究。本文主要介绍了冷等离子体的产生、相关设备和影响其工作效率因素，并从抑制微生物生长和亚硝酸盐替代两方面综述该技术在肉品保藏及加工中的应用。

　　等离子体通常被称为物质的第4种状态，它可以由任何中性气体在高电压下高度电离产生具有正、负电荷的离子、自由电子、自由基、激发或未激发的分子和原子及紫外光子等，整体呈中性的状态。当电子与其他气体物质处于热力学平衡状态时，等离子体被归类为高温等离子体；当电子与其他气体物质处与非平衡态时，等离子体被归类为低温等离子体。低温等离子体在大气压或低压（真空）条件下获得，它的一个重要特征是能够在接近环境温度（30～60℃）下产生大量化学活性物质，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），其中ROS是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括臭氧、过氧化氢、单线态氧分子、超氧阴离子自由基、羟自由基等。RNS是指以一氧化氮（NO）为中心的衍生物，包括二氧化氮（NO2）、三氧化二氮（N2O3）、四氧化二氮（N2O4）等氮氧化物。ROS和RNS的高反应活性使其对肉品中微生物的抑制和亚硝酸盐的产生具有独特的作用。低温等离子体技术可在环境温度和大气压条件下进行操作，对于食品工业来说具有安全、温和、操作简便和节约成本等优点。

　　低温等离子体常用的发生系统包括介质阻挡放电（dielectrical barrier discharge，DBD）、大气压等离子体射流（atmospheric plasma jet，APPJ）、滑动电弧放电和电晕放电，其中DBD和APPJ低温等离子体发生系统由于设备结构简单、操作方便，在食品研究中应用较为广泛。DBD低温等离子体发生系统由两个金属电极组成，其中至少有一个金属电极被覆盖一层电介质（图1A）。当在电极间施加足够高频率的交流电时，电极间的气体被击穿而放电，产生等离子体，电介质使等离子体均匀地分布在整个放电空间。DBD也被称为无声放电，具有能在常温常压下稳定均匀地产生大面积等离子体的优点。APPJ低温等离子体发生系统由两个同心电极组成（图1B），气体（或气体混合物）在两电极间流动，电极间施加高电压引起气体离子化，产生的等离子体通过喷嘴引导到位于几毫米下的食物表面。APPJ的最大优势是等离子体从喷嘴射出，使得等离子体与高压电极分离，操作者的安全性有极大提高。

图 1  低温等离子体发生系统示意图

　　1.2.1  处理变量

　　低温等离子体的工作效率取决于多种处理变量，包括处理时间、处理电压、处理方式和气体类型。处理时间的延长会使低温等离子体中的ROS等活性物质的浓度增加，施加更高的处理电压会使产生的低温等离子体中高能粒子的密度增加，进而使工作效率提高。低温等离子体的处理方式包括直接处理和间接处理。其中直接处理是将样品作为接地电极直接暴露于低温等离子区域中，间接处理是将金属网作为接地电极置于样品与等离子体区域之间。直接处理比间接处理显示出更好的效果，这一差异的主要原因是接地金属网屏蔽掉了低温等离子体中的带电粒子。另外，工作气体种类决定了产生的低温等离子体中活性物质的种类和数量。Kim等研究了不同气体组合如He、He＋O2、N2、N2＋O2所产生的低温等离子体对大肠杆菌的抑菌效果，发现N2＋O2气体组合的效率最高。推测N2和O2离子化后会产生更多的ROS和RNS等活性物质，可作为抗菌剂。一般来说，惰性气体如氩气和He最适合用于低温等离子体灭菌研究，但带电的氦离子和氩离子寿命很短，而且He和氩气比普通的双原子气体贵，因此通常不会单独使用。

　　1.2.2  环境因素

　　环境因素如pH值、相对湿度和样品性质对低温等离子体的有效性有显著影响。例如，固体和液体样品与等离子体产生的活性物质的作用效果不同，因为大多数高活性等离子体物质不能穿透液体。相对湿度的增加会使附加的水分子分解成更多的羟自由基，增加其灭菌的效率。另外，pH值较低的样品对热、压力和脉冲电场的反应更加敏感。研究发现，与pH7相比，肠炎沙门氏菌细胞更容易在pH 5环境下被低温等离子体灭活。

　　肉与肉制品的腐败变质主要源于微生物的污染，肉类工业采用的传统杀菌方法包括加热（巴氏灭菌和高温杀菌）、降低温度（冷冻和冷藏）、降低水分活度（加糖、加盐或干燥）和添加防腐剂等；其他常见方法包括使用栅栏技术、调节pH值、添加香辛料提取物和采用气调包装等。然而，热处理通常导致一些不良的化学/生物化学和感官特性的变化，或形成对最终产品的营养价值、风味、颜色和质地有负面影响的副产品。随着健康意识的提高，消费者更喜欢天然和最低限度加工的食品。因此，对非热处理技术的研究很有必要，其不仅对食品的影响最小，而且可通过抑制或杀灭微生物来延长产品的保质期。在肉类加工方面应用的非热处理技术包括脉冲电场、高压处理、脉冲光、微波和辐照等。

　　低温等离子体处理技术是最近发现和应用的一种肉和肉制品微生物抑菌技术，在常温下通过电离气体产生大量具有抑制微生物生长的ROS和RNS，这些活性物质通过与肉及肉制品表面相互作用，达到抑制或杀灭微生物的效果。低温等离子体技术作为一种温和的非热处理技术具有很多优点，如处理温度低、对营养破坏少、能最大限度地保持原有的感官特性、无毒副产品以及成本低等优点，成为常规杀菌技术的替代品。低温等离子体杀菌已被广泛用于各类食品中，包括果蔬、沙拉以及农产品等，而近年来该技术在肉及肉制品方面的应用为其在食品灭菌领域中的推广开启了新方向。

　　2.1.1  低温等离子体对微生物抑制作用的机制

　　据报道，低温等离子体可以通过多个途径抑制微生物生长，包括紫外光辐射诱导DNA损伤、自由基修饰、脂质过氧化导致细菌膜崩解以及带电粒子诱导细胞凋亡。在最初研究中发现，由离子化产生的紫外光辐射直接诱导的微生物DNA损伤被认为是抑制微生物生长的主要原因。这是由于波长在260nm左右的紫外线可以导致同一条DNA链上的胸腺嘧啶和胞嘧啶形成二聚体，严重破坏细菌的复制能力，从而阻止细胞增殖。低温等离子体产生的羟自由基引起膜蛋白发生的化学修饰和降解被认为是低温等离子体灭菌作用的另一途径。另外，细胞膜的氧化损伤也被认为可能是低温等离子体杀死细菌的原因。ROS可能通过与脂质相互作用改变生物膜的功能，导致多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fattyacid，PUFA）氧化，使PUFA失去一个氢原子，产生脂肪酸的基团，随后被O2氧化为脂氢过氧化物，破坏了细菌的外膜。还有研究表明，细胞上带电粒子的累积可能诱导细胞凋亡，产生的等离子体中的带电粒子撞击细胞表面产生静电斥力超过了细胞膜的抗拉强度，诱导细胞膜破裂，使包括钾、核酸和蛋白质在内的细胞组分渗漏，最终导致细胞死亡。迄今为止，低温等离子体的抑菌机理只在理论上提出了初步解释，对于细胞靶标以及低温等离子体作用的分子机制尚不完全清楚。

　　2.1.2  对肉与肉制品中微生物的抑制作用

　　原料肉在有氧条件下冷藏和贮存时极易被嗜冷微生物污染。对原料肉中嗜冷菌的抑制是一个技术难题。Ulbin-Figlewicz等使用He和氩等离子体处理猪肉，结果表明He等离子体处理具有显著的抑菌作用，猪肉中的微生物总数、酵母及霉菌和嗜冷微生物分别减少了约1.90、1.14、1.60（lg（CFU/g）），并且随着处理时间的延长其效力增加。相比之下，氩等离子体抑制微生物生长的作用较低。Dirks等报道DBD低温等离子体能够有效地抑制去皮鸡胸肉及鸡大腿皮肤表面的微生物生长，可将微生物总数降低一个对数周期。这些研究表明低温等离子体处理可有效地抑制原料肉中的嗜冷菌和微生物的生长，从而延长产品的货架期。

　　大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌通常被认为是肉及肉制品中最常见的食源性致病菌，可导致严重的疾病甚至死亡，对它们的抑制和杀灭是确保产品微生物安全的基础。Jayasena等研究了DBD等离子体处理对猪肉和牛肉样品上接种的单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的影响。研究发现，低温等离子体处理10min后，猪肉样品中单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌数量分别减少2.04、2.54、2.68（lg（CFU/g）），牛肉样品中这3种菌分别减少1.90、2.57、2.58（lg（CFU/g））。Kim等利用低温等离子体技术有效减少了接种在切片培根上的单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长，提高了产品的安全性和货架期。Kim等将大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌接种于猪里脊肉中，研究低温等离子体的抑菌作用。结果表明，将猪里脊肉暴露于DBD等离子体（3kV、30kHz）中，10min后大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌分别减少了0.55、0.59（lg（CFU/g））。这些实例表明，低温等离子体可以通过灭活食源性病原体来提高肉及肉制品的安全性并延长货架期。

　　干制肉制品（例如干鱿鱼丝和牛肉干）在生产过程中常会受到微生物污染。低温等离子体技术也可用于抑制脱水肉制品表面的微生物生长。Kim等报道低温等离子体技术可以有效降低牛肉干表面金黄色葡萄球菌的数量。利用大气压等离子射流处理10min后，牛肉干样品上的金黄色葡萄球菌数量降低了3～4（lg（CFU/g））；扫描电子显微镜观察表明，金黄色葡萄球菌细胞崩解成碎片，并产生许多孔洞。这表明低温等离子体中的活性物质对金黄色葡萄球菌有灭活作用。Choi等也研究了低温等离子体技术对干鱿鱼丝中微生物的抑制作用。使用20kV脉冲直流电压和58 kHz频率产生低温等离子体，干鱿鱼样品经过3min处理后，好氧细菌、海洋细菌和金黄色葡萄球菌数量分别减少2.0、1.6、0.9（lg（CFU/g））。还观察到酵母菌和霉菌污染减少了0.9（lg（CFU/g））。这些研究表明，低温等离子体技术有效抑制了干制肉制品中的金黄色葡萄球菌等微生物的生长。

　　2.1.3  对包装肉类产品中微生物的抑制作用

　　低温等离子体处理对于经过包装的肉类食品的抑菌具有很大的意义。将密封包装后的食品置于DBD的两个电极之间，在通入足够高频率的交流电压后，包装内部

　　的气体被激发放电，产生等离子体对包装后肉类食品进行灭菌，有效避免了先杀菌后包装造成的二次污染。对包装食品进行低温等离子体杀菌的优点是产生的活性分子充满在包装袋中，可以与细菌充分接触，起到有效的杀菌作用；同时在食品贮存24h内可恢复为原始包装气体，不会产生化学残留，无毒无害。R?d等研究了低温等离子体对于接种无害单核细胞增生李斯特菌的切片即食（ready-to-eat，RTE）肉制品的杀菌效果。结果显示，间接低温等离子体处理可以抑制密封的线性低密度聚乙烯袋内RTE肉制品表面上的无害单核细胞增生李斯特菌生长，在一定条件下可以进行多次间隔的处理来增加杀菌效果。Lee等也研究了DBD低温等离子体对包装后鸡胸肉中微生物的影响，结果发现等离子体处理10min后，需氧细菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的数量分别减少了3.36、2.14、2.73、2.71（lg（CFU/g））。最近Wang Jiamei等的研究发现，低温等离子体处理气调包装后的肉类食品可最大限度地降低其微生物水平。实验表明，相比于空气包装，使用气调包装（65%O2＋30%CO2＋5% N2）激发形成的等离子体对鸡肉表面的致病菌有更好的杀菌效果，且包装鸡肉的保质期可延长至14d；同时低温等离子体处理后的鸡肉颜色变化不明显。这些研究表明低温等离子体技术对包装后肉类食品具有良好的抑菌作用。低温等离子体技术应用于包装食品的杀菌处理对于肉品行业，特别是热敏感性食品以及生鲜肉类的品质控制具有较大意义。

　　2.1.4  对肉类加工机械中微生物的抑制作用

　　在肉类工业中，由加工设备造成的不同批次肉之间交叉污染引问题起人们的关注。在肉类加工过程中，连续地对刀具进行杀菌处理可显著降低交叉污染的风险。

　　Leipold等首次研究了空气中大气压下使用DBD低温等离子体对旋转切肉刀的实时消毒。他们将无害单核细胞增生李斯特菌接种到刀片上，将旋转圆刀表面（图2）的一部分暴露于DBD反应器中，其中刀本身作为DBD的接地电极，环境空气作为工作气体。刀的另一部分可进行对肉类的加工。刀在旋转过程中实现了对整个刀具的消毒处理。结果显示，在5.7min后工业旋转切肉刀上无害单核细胞增生李斯特菌最多可减少5（lg（CFU/g））。有效降低了不同批次肉之间交叉污染的风险。因此，低温等离子体技术在肉制品加工机械中的应用具有良好的发展前景。

　　2.2.1  亚硝酸盐替代作用的研究

　　亚硝酸盐作为腌制肉制品中常用的添加剂，具有抑菌、抗氧化、改进腌制品颜色和风味等作用。肉制品中的亚硝酸盐一般有两个来源，即化学合成亚硝酸盐和天然产物中含有的亚硝酸盐。化学合成亚硝酸盐如NaNO2具有使用方便和价格低廉的特点，但人们发现其与肉制品中的次级胺类物质反应会形成强致癌物质N-亚硝胺。天然亚硝酸盐可来源于含有硝酸盐的蔬菜，如芹菜和菠菜等。蔬菜提取物中含有的硝酸盐被硝酸盐还原酶转化为亚硝酸盐，添加到腌制肉制品中可以替代NaNO2的使用。然而，使用蔬菜提取物作为天然的亚硝酸盐来源会带来其他问题，其含有的天然色素和特有的气味会导致不良的感官特性。此外依靠蔬菜提取物加入肉制品中替代亚硝酸盐，可能会使产品中亚硝酸盐的含量低于要求的NaNO2水平，导致天然腌制肉制品的微生物安全性低于NaNO2腌制肉制品。另外，部分人群对用于天然亚硝酸盐生产的芹菜有过敏反应。因此，腌制肉制品需要新的亚硝酸盐来源。近年来的研究发现，低温等离子体处理可用来产生天然亚硝酸盐，替代腌制肉类加工中的NaNO2添加。

　　2.2.2  低温等离子体处理产生亚硝酸盐

　　环境中O2和N2分子被等离子体源放电层中的高能电子激发，产生RNS和ROS。在生成的RNS中存在氮氧化物，例如NO、NO2、N2O3和N2O4。NO微溶于水，NO2、N2O3和N2O4能溶于水发生不可逆的反应，并通过反应（1）～（3）参与亚硝酸盐的生成。结合紫外-可见分光光度计，监测在270～400nm波长范围内的吸收光谱来定量亚硝酸盐（NO2－）和硝酸盐（NO3－）的浓度。

　　2.2.3  低温等离子体处理对肉品品质特性的影响

　　A.  DBD低温等离子体系统处理蒸馏水；

　　B.  安装在肉类搅拌机的顶部的DBD等离子体系统。

　　Jung等利用低温等离子体处理蒸馏水，如图3A所示，使用平均功率为3.14 W、频率为15 kHz的DBD低温等离子体系统处理120 min后，在接地电极表面的开放区域电离环境气体，放电产生RNS和ROS等活性物质。使用紫外-可见分光光度计测得等离子体处理水（plasma-treated water，PTW）中产生了782 mg/L亚硝酸盐和358 mg/L硝酸盐。使用相同NO2－质量浓度的PTW、芹菜提取物和NaNO2制作乳液型香肠，并与不含亚硝酸盐制作的香肠对照组进行比较，测定各组香肠物理化学指标。结果表明，在4℃下贮藏28d内，加入PTW制作的乳液型香肠，其总需氧菌数、颜色、过氧化值和感官品质等性质与添加NaNO2腌制的香肠差异不显著；而且相比于添加芹菜提取物的香肠，加入PTW的香肠味道和总体可接受性更高。因此，PTW可以作为天然亚硝酸盐来源，且在使用中不需要考虑蔬菜提取物替代亚硝酸盐的使用局限性和产生的不易接受的感官特性。Jung等将DBD等离子体系统安装在肉类搅拌机的顶部，如图3B所示，产生的低温等离子体被运送到搅拌室与肉糜中的液体相互作用形成亚硝酸盐。他们进一步研究了低温等离子体对肉糜的物理化学特性的影响，结果表明，低温等离子体处理赋予肉特有的红色，并且肉糜的过氧化值没有显著增加，但是对肉糜中的需氧菌抑制效果不够明显。这与Jung等的结论相反。众所周知，低温等离子体中的活性物质可能通过破坏细胞膜以及通过对微生物DNA修饰而导致微生物的死亡。然而，活性物质的寿命很短，小于2.7μs，并且其穿透深度很浅。这种差异可能是由于活性物质在从等离子室到搅拌室的传递过程中活性丧失，不足以杀死微生物。除此之外，低温等离子体的杀菌效果主要受微生物对等离子体的暴露时间的影响，且仅发生在目标样品的表面。在本研究中，对肉糜的低温等离子体处理与混合搅拌过程同时进行，可能导致好氧细菌在低温等离子体下的暴露时间较短，不足以杀死微生物。Lee等利用低温等离子体处理灌装火腿也得到类似的结论，肉糜混合过程中直接用低温等离子体处理可替代腌制肉制品加工过程中NaNO2的添加。如果能够通过对产生低温等离子体的设备进一步改造以改善低温等离子体的杀菌效果，该技术将在肉制品加工中具有更好的应用前景。

　　低温等离子体中存在的ROS和RNS在肉品微生物灭活和亚硝酸盐生成过程中起着关键作用，然而，ROS特别是羟自由基、超氧阴离子自由基和过氧化氢，通过从脂质中夺取氢离子，促进脂质氧化的自由基链式反应，进而可能导致肉品风味的损失。Jayasena等发现，随着等离子体处理时间的延长，猪肉和牛肉中的脂肪氧化程度增加。并且牛肉样品的脂肪氧化值略高于猪肉样品，这可能归因于两种肉的脂肪含量和脂肪酸组成的差异。并且，经等离子体处理10min后，牛肉样品的感官评分略有降低。R?d等报道，随着等离子体激发功率和时间的延长，即食肉制品中的脂肪氧化程度增加。Kim等报道，与对照样品相比，用低温等离子体处理后培养7d的培根中脂肪氧化程度增加。然而，Jung等的实验结果表明，与对照样品相比，经低温等离子体处理过的肉糜的硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量没有发生显著的变化。这种差异可能是由于不同样品中脂肪含量和脂肪酸组成不同或等离子体中ROS物质的寿命短造成的。Mattison等报道，当肉的TBARS含量超过1.0mg/kg时，可以检测到肉的脂肪酸败。在一些研究中，虽然TBARS含量随着等离子体处理时间的延长而逐渐增加，但均远小于1.0mg/kg的脂肪氧化酸败临界值。另外，Lee、Kong Qiulian等报道，γ射线或电子束辐照后肉的脂肪氧化程度迅速增加。用低温等离子体处理的样品中TBARS含量的变化要小于其他非热处理样品。因此，低温等离子体技术可能是很好的用于高脂肪食品的非热加工技术。

　　低温等离子体技术是一种具有高应用潜力的新兴非热能加工技术，与传统热能技术相比，其显示出一些独特的优势，包括安全、温和、无破坏性、操作简便和成本较低，为肉品工业存在的一些问题提供了解决方案，包括其杀菌作用和亚硝酸盐替代作用。然而，该技术目前还存在着一些问题。首先，由于等离子体、微生物和肉品种类的复杂性，导致对细胞靶标和分子机制仍然缺乏深入的探讨，需要进行更深入地研究。其次，由于等离子体穿透深度不大，对于深入肉品组织内部的细菌，其灭菌效果还不够好。因此，可以将其他非热能处理技术作为一种辅助手段，与低温等离子体技术联用以提高其杀菌效率，进而更有效地提高肉类产品的安全性和货架期。另外，低温等离子体产生的高活性ROS会对肉中脂肪氧化产生促进作用，最终可能对肉品的风味产生不良影响，因此可采用添加天然抗氧化剂等方法延迟或抑制脂肪氧化以预防低温等离子体处理对肉品品质的影响。

　　近几年来，低温等离子体技术在肉品研究中的应用取得了较大发展，但仍处于基础研究阶段，尚未实现大规模的产业化，低温等离子体源的设计直接影响其在肉品工业中未来的发展。目前，各种低温等离子体源设备均无法保证其产生的活性物质与肉品充分、均匀接触，因此今后的研究应着力于研发适合于肉品工业应用的低温等离子体源，并应用于实际的生产中，低温等离子体技术的优势必将为肉品工业的发展起到积极的推动作用。另外，低温等离子体处理对肉及肉制品的感官品质和营养效应的研究甚少，因此未来的研究也应聚焦于低温等离子体与肉品中成分的互作以及对肉品品质的影响方面，也可结合气相色谱-质谱联用方法鉴定等离子体处理肉的挥发性风味组成，进一步研究脂肪氧化对挥发性风味成分的影响。使低温等离子体技术在肉品科学研究中的应用前景更加广阔。